胃癌严重危害我国人民健康，据卫生部资料统计，我国每年胃癌死亡人数占全部恶性肿瘤死亡人数的23.2%，是我国恶性肿瘤致死的最重要原因。胃癌主要的治疗方式有手术、放疗和化疗等，近年来血管靶向治疗因其特异性强、联合放化疗疗效佳而受到青睐，但其日益产生的耐药性严重影响了患者疗效，是我们研究亟待解决的问题。肿瘤血管生成的方式存在多种，目前应用的包括阿伐斯汀在内的血管靶向药物主要针对VEGF通路，阻断内皮祖细胞成熟为内皮细胞，但是肿瘤本身及其间质内可能有其他细胞和通路参与了肿瘤血管生成过程，进而产生不同程度抗肿瘤血管靶向治疗的耐药。而这也是导致阿伐斯汀等血管靶向药物有效率相对较低的主要原因,有效率仅有20%到37%。因此研究肿瘤血管形成的来源及机制对发现抗肿瘤血管治疗新靶点，降低抗血管靶向治疗耐药具有重要意义。肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）的异质性，可塑性导致其功能的多样性，它通过用各种方式为肿瘤提供全方面的生长条件。2011年《自然》杂志首先提出肿瘤内发生染色体变异的内皮细胞由肿瘤干细胞分化而来，这可能是肿瘤内部血管生成的一种重要方式。近年来文献报道在血管较丰富的神经胶质瘤内部，70％的内皮细胞由肿瘤干细胞分化而来。那么胃癌肿瘤干细胞是否参与了向内皮前体细胞分化的过程，是否是肿瘤内部血管生成的一个主要来源，这个转化过程中涉及的分子机制有哪些，研究清楚这些问题会让我们对胃癌血管的发生，发展有更全面的认识，从而为胃肿瘤血管靶向治疗提供新的治疗靶点。目的：1、诱导鉴定胃癌肿瘤干样细胞（Cancer Stem Like Cells, CSLCs），2、研究胃癌肿瘤干样细胞向内皮细胞体外分化的表型及功能，3、研究胃癌肿瘤干样细胞体内生成微血管的潜能。方法：1、诱导胃肿瘤干样细胞：流式细胞仪分选带有绿色荧光蛋白（Green FluorescentProtein,GFP）标记的胃癌细胞系SGC7901细胞，长春新碱预筛选后，以每孔200个细胞接种到低粘附96孔板中，采用含有表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, b-FGF）的无血清培养基培养（亦即培养肿瘤干细胞的标准培养条件），三周后得到SGC7901来源的肿瘤干样细胞：2、鉴定胃肿瘤干样细胞：利用肿瘤干细胞的高致瘤性，通过最低克隆球数裸鼠成瘤实验验证诱导的胃癌肿瘤干样细胞的成瘤性，以达到鉴定胃癌肿瘤干样细胞的目的；3、表型验证：将经过鉴定的一部分细胞，在含有内皮生长因子（VascularEndothelial Growth Factor, VEGF）等血管内皮生长因子的M200培养液中培养，通过Western blot、细胞免疫荧光方法对胃癌细胞SGC7901组，肿瘤干样细胞组，内皮环境下刺激肿瘤干样细胞组，原代内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HuVEC）组这四组细胞检测内皮标志CD31，CD34的表达情况；4、体外功能实验：四组细胞成管实验验证经诱导的肿瘤干样细胞在内皮环境的刺激后，是否具有内皮特性，能否形成管样结构；5、裸鼠皮下成瘤实验：经鉴定的另一部分细胞，进行裸鼠皮下成瘤实验。10只裸鼠左右分别接种5×10~6个SGC7901和5×10~6个CSLCs，4周后取肿瘤，做大小重量统计分析；6、移植瘤石蜡包埋，免疫组织化学分析：人源血管内皮标志hCD31、hCD34染色，人胃癌组织设为阳性对照，SGC7901细胞成瘤组织设为阴性对照，肿瘤干样细胞成瘤组织为实验组，观察移植瘤内部人源性微血管的形成。结果：1．胃癌肿瘤干样细胞球形克隆的培养及成瘤能力的鉴定成功诱导胃癌肿瘤干样细胞：经3周诱导得到SGC7901来源的胃癌CSLCs在低粘附培养板中形成克隆球，形态均一，生长状态良好（图1）。200个，1000个球形克隆分别接种于4-6周龄裸鼠两侧皮下，4周后裸鼠状态良好，左右两侧均有移植瘤形成（图2），此实验证实培养诱导的胃癌CSLCs具有显著的成瘤能力。2．体外验证胃癌肿瘤干样细胞向内皮分化的表型及功能Western blot分析，实验组为胃癌CSLCs组和内皮环境下刺激CSLCs组，SGC7901组设为阴性对照，HUVEC组为阳性对照。收集各组细胞提取细胞蛋白进行Westernblot检测，结果表明实验胃癌CSLCs组和阴性对照SGC7901组内皮细胞蛋白几乎无表达，而内皮环境下刺激的CSLCs组CD31,CD34的表达和阳性对照HUVEC组相比无明显差异。用ChemiDocXRS+Imaging System (Bio-Rad)进行条带扫描，Quantity Onev4.6.2software (Bio-Rad)软件进行灰度分析，内皮环境下刺激的CSLCs组内皮表面蛋白CD31,CD34表达明显升高，与内皮环境刺激之前CSLCs和阴性对照相比有统计学意义（图3）。利用免疫荧光法检测各组细胞内CD31，CD34蛋白的表达。结果显示，接受VEGF的刺激后,内皮标志物CD31，CD34在CSLCs的表达与刺激之前相比，细胞膜CD31，CD34表达量明显提高，且形态为圆形或椭圆形，边界清楚，细胞核染色无明显变化（图4）。证实内皮环境的特异性诱导可以明显促进CSLCs中内皮标志蛋白的表达，这提示CSLCs的多向分化潜能，在VEGF等特定微环境的诱导下可向内皮细胞分化。成管实验分组与上述实验分组情况相同，结果显示：HUVEC在Matrigel基质胶上形成明显管腔样结构，SGC7901细胞无变化，而CSLCs在内皮环境的刺激后较无刺激的CSLCs具有较强的成管能力（图5）。3.体内验证胃癌肿瘤干样细胞的内皮分化潜能实验设计10只4-6周龄裸鼠，分两组皮下分别接种SGC7901细胞（5×10~6个）和CSLCs（5×10~6个）。4周后，取出肿瘤，进行大小重量统计分析：SGC7901移植瘤组肿瘤大小为0.5cm-0.8cm、重量0.3g-1.0g，CSLCs移植瘤组肿瘤大小为1.0cm-2.0cm、重量1.0g-2.5g (图6)。移植瘤石蜡包埋,免疫组化分析结果显示，在CSLCs移植瘤的组织切片用人源性血管内皮标志hCD31和hCD34染色，结果可观察到明确的人源性微血管形成，而在SGC7901细胞成瘤组织切片中未见人缘性内皮细胞（图7，8）。提示在移植瘤的内环境中由肿瘤干样细胞逐渐向内皮细胞转化，在肿瘤内部形成肿瘤干细胞来源的微血管。结论：本课题成功诱导并鉴定SGC7901来源的胃癌肿瘤干样细胞。通过表型和功能的研究初步证实在体外内皮环境的刺激下，胃癌肿瘤干样细胞具有向内皮分化的潜能；体内裸鼠成瘤试验表明胃癌肿瘤干样细胞形成的移植瘤中含有人源性内皮细胞，提示肿瘤干细胞可能参与胃癌肿瘤血管的生成过程。