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结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中位居第四,严重威胁人类的健康。近年来结肠癌的发病率仍呈不断上升趋势。磷脂酶D(PhospholipaseD, PLD)是维持机体正常功能的重要酶类,在哺乳动物体内存在两种亚型：PLD1和PLD2。多种癌症中均伴有PLD的异常表达和活化现象,虽然大量文献报道PLD涉及参多种类型肿瘤的进程,但是,对PLD的调控和作用机制我们仍所知甚少。Wnt/β-catenin信号通路的异常活化以及靶基因的过度活化与多种癌症相关。最新研究揭示PLD作为P-catenin/T-cell factor (TCF)的转录靶标,并通过PLD强化细胞的增殖和转移。然而,对Wnt信号通路参与PLD的作用机制的报道还比较少。本课题将以这一方向展开研究,继续深入探讨PLD与Wnt信号通路之间的关系。我们以体外培养的人结肠癌细胞系KM12C、 KM12SM, PLD稳定转染细胞株和裸鼠荷结肠癌模型为研究对象,对PLD的生物学功能以及调节机制进行了较为深入的探讨,尤其是探讨PLD与Wnt信号通路在诱导细胞增殖和侵袭中的作用机制。我们首先采用MTT法分别测定两种细胞系经PLD质粒转染24h后的细胞增殖存活率。结果表明,PLD对KM12C和KM12SM细胞具有明显的存活促进作用。为了探讨PLD是否具有诱导人结肠癌细胞迁移的能力,我们首先采用细胞划痕实验,观察到PLD可以有效诱导KM12C和KM12SM细胞发生迁移。同时,我们还用western blot检测了PLD对β-catenin蛋白在细胞核和细胞浆内的表达变化的影响。结果发现在PLD过表达的KM12C和KM12SM细胞中β-catenin蛋白在细胞核内的表达水平均明显提高,细胞质中的β-catenin蛋白表达水平降低。进而我们观察经不同浓度PLD质粒转染的KM12C细胞中Wnt下游基因c-Myc和cyclinD1的细胞全蛋白表达水平。结果显示,c-Myc和cyclinD1的蛋白表达量随着PLD的表达增多而升高,而β-catenin蛋白表达的变化不明显。接着,我们构建了高表达PLD的人结肠癌细胞KM12SM稳定转染细胞株,为了进一步的探究PLD在结肠癌细胞中的作用机制,我们分别采用了MTT、Realtime PCR、荧光素酶报告基因和transwell细胞侵袭的实验方法检测了PLD稳定转染细胞株的生物学功能和Wnt信号通路活性的变化情况。MTT的结果显示稳转株细胞增殖率较对照组细胞显著提高；Realtime PCR和荧光素酶报告基因实验的结果显示,稳转细胞株中Wnt/β-catenin的转录活性显著提高,靶基因c-Myc、 cyclinD1的mRNA表达水平也明显上升；transwell细胞侵袭实验和western blot的结果显示,稳转细胞株中MMP2和MMP9的全蛋白表达水平以及细胞迁移、侵袭能力均显著提高。最后,建立裸鼠移植瘤模型,证实高表达PLD可以在裸鼠体内促进人结肠癌KM12SM细胞的增殖生长,并同步观察到肿瘤组织中P-catenin蛋白在细胞核内的表达显著提高,Wnt信号通路下游基因c-Myc、 cyclinD1和细胞增殖标志蛋白PCNA、 Ki67的表达水平均明显增强。综上所述,本论文的研究结果证实了PLD具有促进人结肠癌细胞的存活增殖及细胞迁移、侵袭的能力,并且显示PLD通过提高Wnt信号通路的活性促进人结肠癌细胞增殖和转移,促进β-catenin蛋白入核进而转录活化Wnt信号通路靶基因的表达可能是其调节结肠癌细胞增殖和转移的分子机制之一。通过这些研究,较为详细地阐明了PLD在体内外对人结肠癌细胞存活增殖的促进作用与机制,为以PLD为靶点的肠癌药物开发奠定理论基础。