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华蟾素注射液在我科运用已有多年的历史,我们应用华蟾素注射液,综合治疗中晚期原发性肝癌,获得了一定的临床疗效.另外,临床实践还证实,华蟾素具有一定的抗肝癌术后复发转移的效果.但华蟾素注射液的有效成份及其含量的始终未能明确,我们在参考国内外对蟾蜍抗肿瘤研究报导的基础上,进行了一系列实验研究,初步证明了华蟾素注射液治疗肝癌的有效成份及其可能的作用机制.1.检测了华蟾素注射液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基三种成份的含量.蟾毒灵是国内外研究最多,认为是蟾蜍中抗肿瘤活性最强的成份之一,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基是中国药典中规定的蟾酥的质控成份,检测结果表明华蟾素注射液中蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基浓度分别是0.333μg/ml、0.159μg/ml、0.110μg/ml.2.观察了三种蟾毒单体对肝癌细胞的抑制作用,通过MTT药敏实验,发现蟾毒灵,华蟾酥毒基对人肝癌细胞具有极强的生长抑制作用,对肝癌细胞生长抑制作用均高于丝裂霉素.两单体对肝癌细胞的杀伤作用局限在一定较窄的范围内,即蟾毒灵在10<-7>mol/L~10<-8>mol/L华蟾酥毒基在10<-6>mol/L~10<-7>mol/L之间,高于此浓度时,在作用96小时后,细胞几乎完全被杀伤,而低于此浓度时,对肿瘤细胞几乎无杀伤作用.3.通过锥虫蓝拒染实验和细胞周期检测等方法观察了三种蟾毒单体对人肝癌细胞形态、膜完整怀、细胞DNA含量和血管内皮生长因子分泌量等指标的影响.4.初步探索了蟾毒灵抗肝癌作用的部分作用机制,通过免疫组化方法,观察10<-6>mol/L蟾毒灵作用6小时,对正常肝细胞系L-02和人肝癌PLC/PRE/5细胞系BCL-2,BAX,COX-1,COX-2蛋白表达的影响,发现蟾毒灵可抑制肝癌细胞BCL-2蛋白表达,升高BAX蛋白表达,显著降低BCS-2/BAX比例,对COX-1蛋白的影响不明显,但可明显抑COX-2蛋白的表达.从基因蛋白表达的角度部分解释蟾毒灵抑制肿瘤细胞生长,抑制血管生成和逆转肿瘤细胞化疗耐药的作用机制.5.探索提高华蟾素注射液抗癌效果的方法,通过体外MTT药敏实验观察华蟾素临床用药浓度、10倍和100倍临床用药浓度对肝癌细胞的生长抑制作用.华蟾素注射液对人肝癌细胞具有一定的生长抑制作用,这种生长抑制作用随药物浓度的增高和作用时间的延长而增加.在华蟾素中加入10<-8>mol/L蟾毒灵,对肝癌的生长抑制作用可由30％提高到51％,使肝癌细胞凋亡比例明显增高,显著提高华蟾素注射液对肝癌细胞的生长抑制和诱导凋亡作用.以上研究,不仅初步确定了华蟾素注射液的有效成份及有效剂量,而且部分阐明了华蟾素治疗肝癌的作用机制.为进一步改进华蟾注射液的有效成份配伍,提高临床疗效提供了科学的实验依据.