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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的好发于中老年人的中枢神经系统退行性疾病,病理特征是多巴胺(dopamine,DA)神经元进行性变性、凋亡。目前关于该病的确切发病机制尚不知晓,但神经炎症与PD的发生有着密切的关系。抑郁症是一种全球性精神疾病,且发病率呈现逐年上升的趋势,目前研究显示神经炎症可以促进抑郁症的发生、发展。研究显示慢性不可预见性应激(Chronc Unpredictable Mide Stress,CUMS)导致的下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic–pituitary–adrena axis,HPA)轴亢奋,皮质酮(Corticosterone,CORT)分泌异常可致抑郁的发生。另外也有研究发现抑郁患者较非抑郁患者更易罹患PD,揭示抑郁可能为PD的独立危险因素。鸡豆黄素A(Biochanin A,Bio A)作为植物类雌激素可以抑制小胶质细胞的活化,但在抑郁伴PD模型中是否有这样的作用及其可能的作用机制尚不明确。目的:研究CORT预处理对LPS激活小胶质细胞的调节作用,鸡豆黄素A对小胶质细胞活化的抑制作用。方法:1.采用MTT法,检测LPS对BV2的激活作用,筛选出适宜的造模浓度。将常规培养的BV2细胞分为6组:(1)Control组;(2)LPS(0.01μg/ml)组;(3)LPS(0.1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)组;(5)LPS(10μg/ml)组;(6)LPS(100μg/ml)组,除Control外,其余每组加入相应浓度的LPS孵育36h。2.采用MTT法,检测鸡豆黄素A对BV2的损伤作用,筛选出适宜的保护药物浓度。将常规培养的BV2细胞分为6组:(1)Control组;(2)Bio A(2.5μM)组;(3)Bio A(5μM)组;(4)Bio A(10μM)组;(5)Bio A(20μM)组;(6)Bio A(40μM)组。除Control外,其余每组加入相应浓度的Bio A孵育36h。3.采用Geriss法检测各组细胞上清液中的NO含量来观察不同浓度的皮质酮预处理对LPS激活小胶质细胞的调节作用。将常规培养的BV2细胞分为7组:(1)Control组;(2)LPS(1μg/ml)组;(3)CORT(25n M)+LPS(1μg/ml)组;(4)CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组;(5)CORT(100n M)+LPS(1μg/ml)组;(6)CORT(200n M)+LPS(1μg/ml)组;(7)CORT(400n M)+LPS(1μg/ml)组。除Control外,各组先加入不同浓度的CORT孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)共同孵育36h。4.采用Geriss法检测各组细胞上清液中的NO含量来观察皮质酮预处理对LPS激活小胶质细胞的调节作用及Bio A对细胞的保护作用。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h。5.用显微镜直接观察各组细胞的细胞形态变化和DCFH-DA探针法检测各组细胞的ROS情况来检测皮质酮预处理对LPS激活小胶质细胞的调节作用及Bio A对细胞的保护作用。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h。6.用Western-blot法检测各组BV2细胞中5-HTT的蛋白表达水平。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h后提取蛋白进行检测。7.用Western-blot法检测各组BV2细胞中GR和MR的蛋白表达水平。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h后提取蛋白进行检测。8.用Western-blot法检测各组BV2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h后提取蛋白进行检测。9.用Western-blot法检测各组BV2细胞中炎症小体相关蛋白ASC、Caspase-1和NLRP3的蛋白表达水平。将常规培养的BV2细胞分为5组:(1)Control组;(2)CORT(50n M)组;(3)LPS(1μg/ml)组;(4)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)组;(5)LPS(1μg/ml)+CORT(50n M)+Bio A(5μM)组。除Control外,各组先加入CORT(50n M)孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS(1μg/ml)和Bio A(5μM)共同孵育36h后提取蛋白进行检测。结果:1.与对照组相比,LPS浓度在1μg/ml以下,细胞的活力呈现明显上升的趋势,当浓度在1μg/ml以上时,细胞的活力又开始出现下降。因而,1μg/ml的LPS是我们实验所需的适宜的浓度。2.鸡豆黄素A浓度在5μM时对细胞基本上没有损伤的作用,当浓度继续增加,Bio A会对细胞产生损伤。因而5μM的LPS是我们实验所需的适宜的浓度。3.CORT浓度在50 n M可以促进LPS诱导BV2细胞产生大量的NO,细胞出现明显的活化。因而,50 n M的CORT是我们实验所需的浓度。4.LPS(1μg/ml)组BV2细胞的上清液中NO含量相比于对照组明显升高;与LPS(1μg/ml)组相比,CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组BV2细胞的上清液中NO含量明显升高;与CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)BV2细胞的NO含量明显降低。5.与CORT(50n M)组和LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组的细胞的ROS的表达量更高,活化状态的“阿米巴”状细胞也更多;与CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)细胞的ROS表达量较低,形态较趋于正常。6.Western-blot检测显示与CORT(50n M)组和LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组细胞的5-HTT的蛋白表达量降低;CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)组5-HTT蛋白表达量较CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组升高。7.Western-blot检测显示与CORT(50n M)组和LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组细胞的GR的蛋白表达量降低,MR的表达量升高;CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)组MR、GR蛋白表达量与CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组相比,GR表达量升高,MR表达量下降。8.Western-blot检测显示与CORT(50n M)组和LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组细胞的炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的蛋白表达量升高;CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)组上述蛋白与CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组相比,其蛋白表达量与上述结果相反。9.Western-blot检测显示与CORT(50n M)组和LPS(1μg/ml)组相比CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组细胞的NLRP3炎症小体相关蛋白ASC,caspase-1,NLRP3的蛋白表达量升高;CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)+Bio A(5μM)组上述蛋白与CORT(50n M)+LPS(1μg/ml)组相比,其蛋白表达量与上述结果相反。结论:1.慢性应激水平的皮质酮预处理可以促进脂多糖激活小胶质细胞。2.鸡豆黄素A抑制皮质酮预处理下脂多糖诱导小胶质细胞活化的机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体的活性。