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自上世纪60年代来急性肾功能衰竭（acute renal failure，ARF）的病死率居高不变，保持在50％左右，治疗仍未超出支持与肾脏替代疗法的范畴。既往认为ARF发病中，细胞主要表现为缺血缺氧/中毒诱发的肾小管上皮细胞坏死。过去十年来，越来越多的证据表明肾小管上皮细胞凋亡在ARF发病机制中发挥重要作用。由于凋亡导致的肾小管上皮丢失和死亡，在中毒性ARF发病过程中发挥主要作用。如何阻止凋亡的发生发展，保护肾小管上皮细胞免于凋亡的发生，成为研究的热点。 原癌基因Bcl-2是公认的抗凋亡基因，但其对不同致伤因子导致不同组织来源的细胞凋亡的调控作用有所差异，有关Bcl-2蛋白在创伤后急性肾功能衰竭中的作用研究资料有限。本研究通过逆转录病毒载体介导外源Bcl-2基因的转染，研究过表达Bcl-2蛋白对损伤后肾小管上皮细胞的保护作用，为ARF的救治提供参考。将含有Bcl-2cDNA的逆转录表达载体，经过包装，获取逆转录病毒假病毒，感染肾小管上皮细胞株HK-2，经筛选、鉴定，命名为HK-2Bcl-2，过氧化氢诱导细胞凋亡，流式细胞仪分析细胞凋亡状况；通过建立大鼠甘油肾衰模型，肾内灌注逆转录病毒液感染ARF肾脏组织，免疫组织化学染色观察Bcl-2，Bax表达，研究过表达Bcl-2蛋白能否对抗肾小管上皮细胞凋亡，并对早期肾功能恢复的影响做一探讨。 取得的主要结果如下： 1．本研究将Bcl-2cDNA片段插入到逆转录病毒载体pLXSN，成功构建了逆转录病毒表达载体pLBcl-2SN,转染包装细胞PA317，获得G418抗性细胞，RT-PCR证实其培养液上清含重组逆转录病毒，NIH 3T3测定病毒滴度为104～105CFU/ml． 2．通过病毒液感染人肾小管上皮细胞株，经抗性筛选并鉴定，成功建立了过表达Bcl-2蛋白的肾小管细胞株HK-2Bcl-2，原位杂交显示，转染靶基因组细胞HK-2Bcl-2内Bcl-2 mRNA表达水平较对照组显著增高；Western blot检测表明Bcl-2蛋白表达显著升高。 3．1mM H2O2具有明显的诱导细胞增殖分裂的作用。适度剂量（5mM）H2O2诱导细胞凋亡，建立肾小管上皮细胞凋亡模型。5mM H2O2作用下细胞LDH漏出量8h明显升高，与对照组比较差异显著（p＜0.05），其中HK-2Bcl-2组较HK-2Neo对照组明显降低。第三军医大学博士学位论文台盘蓝拒染实验取得类似结果。流式细胞仪分析表明，在smMHZo:作用下，HK一么HK一ZNe“两组细胞ld后凋亡数量显著上升，3d到高峰，6天略下降;HK一ZBcl一2组较同期HK一ZNe。、HK一2细胞凋亡数量显著降低，差异显著。 4.在大、小剂量甘油注射诱发大鼠急性肾功能衰竭动物实验中，联合病毒液灌注较单纯甘油注射未能降低动物病死率。注射甘油后7d，IOd，小剂量甘油注射联合病毒液灌注组同小剂量甘油注射组比较，BUN和Cr水平显著下降。（p<0.05）;大剂量甘油注射联合病毒液灌注同单纯大剂量甘油注射比较，各时相点BuN和Cr水平无差异。 5.大、小剂量甘油注射后，各时相点PCNA阳性细胞数目显著增加，96h达高峰。甘油注射合并病毒灌注后24h，大鼠肾脏凋亡细胞数目明显增加，与对照组有显著性差异。甘油注射后7d，10d，小剂量甘油注射联合病毒液灌注组同小剂量甘油注射组比较，TuNEL阳性细胞数显著下降（p<0.05）;大剂量甘油注射联合病毒液灌注组同单纯大剂量甘油注射组比较，TUNEL阳性细胞数各时相点无差异。 6.Bd一2在正常对照组肾小管呈弥散性、弱阳性表达;甘油注射后，Bcl一2表达明显升高，Bax表达也相应升高;大、小剂量甘油+病毒灌注后Bd一2呈片状强阳性表达，各时相点较单纯注射甘油组显著升高;小剂量甘油注射+病毒灌注组同大剂量甘油注射+病毒灌注组之间各时相点Bd一2表达无显著差异;小剂量甘油注射联合病毒液灌注组同小剂量甘油注射组比较，Bd一2/Bax比值显著提高。 7.胰岛素样生长因子一l（I GF一1）在正常肾组织呈低水平的表达，甘油注射后7d至10d，IGF一1表达明显升高，小剂量甘油注射+病毒灌注组于7d，IOd表达较小剂量甘油注射组表达更为进一步升高，差异显著（P<0.05），但较Bd一2上调表达明显滞后。 结论: 轻、中等程度缺血/中毒性急性肾功能衰竭中，凋亡在早期肾小管细胞损伤、丢失过程中发挥重要作用。过表达Bd一2蛋白显著抑制HK一ZBcl一2细胞凋亡;Bd一2蛋白过表达通过提高Bcl一2/Bax比值，对抗缺血/中毒性损伤诱发的肾小管上皮细胞凋亡，为局部生长因子自分泌、旁分泌创造条件，促进肾小管细胞再生修复，促进早期ARF肾功能恢复。