紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是一种从裸子植物红豆杉的树皮分离提纯所得的天然次生代谢产物,作为一线抗肿瘤天然药物,目前已广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤的临床治疗。紫杉醇类药物(包括其衍生物多烯紫杉醇和卡巴紫杉醇)是目前唯一临床应用微管蛋白聚合剂,其抗肿瘤机制独特,通过诱导微管蛋白聚合并抑制其解聚,导致肿瘤细胞的有丝分裂过程被固定在G2/M期,从而使肿瘤细胞无法完成有丝分裂过程而死亡。然而,紫杉醇水溶性极差,口服给药生物利用度低,依从性差,临床必须使用毒性增溶剂将药物溶解后进行注射给药,导致患者不良反应发生率较高,严重影响患者生活质量。紫杉醇制剂水溶性和肿瘤组织选择性的缺乏是影响药物使用和发挥疗效的两大关键问题。目前,除了传统溶剂型的紫杉醇注射液外,临床还有人血白蛋白型紫杉醇和紫杉醇脂质体得以应用,此两者均可改善紫杉醇的溶解性能,在保持药理活性的基础上减少毒性增溶剂的用量,降低患者不良反应的发生率。然而,此二者制备工艺复杂,工艺成本较高,导致价格长期居高不下且一直未被纳入国家医保目录,临床治疗成本极高,对患者造成巨大的经济负担。因此,传统溶剂型的紫杉醇注射液仍然是我国目前市场份额最大的紫杉醇制剂。近年,学界提出了通过糖基化修饰提高紫杉醇溶解性的策略,虽然相关研究得到一定程度的推进,但目前研究大多为关于糖缀合物溶解性、亲水性等理化性质的探索,紫杉醇糖缀合物与肿瘤细胞相互作用的机制研究报道较少。异常提高的葡萄糖代谢是肿瘤细胞最明显的生理学特性之一,为了摄取更多的葡萄糖,肿瘤细胞表面葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)的表达水平会出现异常上调,抑制GLUT-1表达可以抑制肿瘤的增殖和侵袭。据此,本文提出对紫杉醇进行糖基化修饰的策略,一方面,紫杉醇的糖缀合物能够通过与葡萄糖转运蛋白互相作用的机制,提高肿瘤细胞对药物的摄取,发挥药物的肿瘤细胞靶向作用;另一方面,强亲水性基团的修饰能提高药物的水溶性。由此,本文设计并合成了紫杉醇不同位点修饰的葡萄糖缀合物TXGDs,包括C-13侧链2’-OH单位点取代的葡萄糖缀合物TXGD-A、C-13侧链2’-OH与巴卡亭母核7-OH同时进行修饰的双位点取代葡萄糖缀合物TXGD-B,两种缀合物均以丁二酸酯作为连接臂。其后,本文对合成的TXGDs进行了体外抗肿瘤活性、抗肿瘤机制、TXGD-A与GLUT-1互作结合程度及肿瘤细胞摄取率的测定,最后进行溶解度、脂水分配/分布系数等方面的研究。结果显示,TXGD-A表现出明显的抗肿瘤活性且可实现与GLUT-1的互作结合,通过该机制提高肿瘤细胞对药物的摄取,提示TXGD-A可能具备作为PTX衍生物进行二次开发的潜力,各项研究结果大致罗列如下:本文首先合成了两种紫杉醇的葡萄糖缀合物TXGDs,包括单位点取代缀合物TXGD-A与双位点取代缀合物TXGD-B,其中TXGD-A修饰位点为侧链2,-OH,TXGD-B的紫杉醇修饰位点为侧链2’-OH和巴卡亭母核7-OH,葡萄糖环的修饰位点均为C-1上羟基,连接臂均为丁二酸酯,经1H NMR、13C NMR及HRMS表征后可判断目标产物已成功合成。其后,本文对TXGDs进行了体外抗肿瘤活性测定,体外肿瘤细胞抑制作用测试结果显示,虽然TXGDs对人乳腺癌细胞和卵巢癌细胞的抑制作用弱于本体药物PTX,但抑制作用依然明显且IC0G可维持在nM量级。TXGD-A对人乳腺癌细胞和卵巢癌细胞的IC50值分别为148.75 nM和1077.15 nM,均低于TXGD-B,提示单位点取代的PTX葡萄糖缀合物体外对肿瘤细胞的抑制作用强于双位点取代的PTX葡萄糖缀合物;促肿瘤细胞凋亡测试结果显示TXGD-A作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞后,有21.23%的肿瘤细胞处于凋亡状态,其诱导凋亡作用明显强于TXGD-B,提示单位点取代的葡萄糖缀合物体外对肿瘤细胞的诱导凋亡作用强于双位点取代的葡萄糖缀合物;TXGDs对人正常乳腺上皮细胞的抑制作用弱于本体药物PTX,提示PTX经糖基化策略修饰后不会对正常细胞造成额外的毒性;微管蛋白动力学测定结果显示TXGDs均具备明显的促微管蛋白聚合作用,各剂量TXGDs给药组的OD值均明显大于空白对照组,提示糖基化策略可保持PTX的抗肿瘤机制,不同浓度单位点取代的PTX葡萄糖缀合物体外对微管蛋白聚合的促进作用均强于同浓度双位点取代的PTX葡萄糖缀合物,不同浓度TXGD-A给药组的OD值可提升至0.391-0.507,明显高于同浓度的TXGD-B。综合肿瘤细胞活力抑制作用、促肿瘤细胞凋亡作用、促微管蛋白聚合作用等多种参数可知,TXGD-A具备更明显的体外抗肿瘤活性,可能拥有更优越的进行药物开发的潜力;肿瘤细胞糖代谢活性显著强于正常细胞但其代谢效率极差,其降低的糖酵解速率需要通过大量的葡萄糖摄取以进行补偿,故肿瘤细胞存在葡萄糖转运蛋白GLUT-1过表达的生理学特征。与被动转运的细胞摄取行为相比,转运体介导的细胞摄取特异性更强,摄取率更高,因此,GLUT-1可能是一个潜在的抗肿瘤治疗靶点。由此,本文对TXGD-A进行了与葡萄糖转运蛋白GLUT-1互作程度及其肿瘤细胞摄取率的测定。首先,本文使用SPRi测定TXGD-A与GLUT-1的相互作用,结果显示,TXGD-A可与GLUT-1结合形成复合物,其解离结合常数Avg Kd为3.76e-6且在不同蛋白浓度环境下其互作程度均极明显优于本体药物PTX(PTX的Avg Kd为2.65e-5),提示PTX经糖基化修饰后可实现药物与GLUT-1的互作结合;激光共聚焦显微镜观察TXGD-A和PTX给药后在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的定位,结果显示TXGD-A和PTX均可被肿瘤细胞摄取至细胞内部且大多定位于细胞质中,TXGD-A的荧光面积大于PTX,提示从形态学观察,肿瘤细胞对TXGD-A的摄取程度高于PTX;摄取率测定结果显示,与本体药物PTX相比,人乳腺癌细胞MDA-MB-231对TXGD-A的摄取高于PTX,给药24 h后,细胞对TXGD-A的摄取率可达35.03%,明显高于PTX。为了研究肿瘤细胞对TXGD-A的摄取率是否与GLUT-1的表达水平相关,本文对细胞进行了 GLUT-1表达水平调控后测定细胞对TXGD-A的摄取率,结果显示细胞对TXGD-A的摄取率受GLUT-1表达水平影响,细胞GLUT-1表达水平上/下调后,TXGD-A摄取率可升/降至60.52%/14.85%;计算机模拟计算TXGD-A与GLUT-1的结合位点,其主要结合位点可能是GLUT-1第161位的谷氨酰胺残基(GLN161)和第380位的谷氨酸残基(GLU380),结合方式为氢键作用。此外,本文还对合成的TXGDs进行了多种理化性质的测定。结果显示,TXGDs在纯水及不同的临床使用注射介质中的溶解度均明显优于PTX,TXGD-A 在纯水和临床用注射介质中的溶解度可达本体药物PTX的44.6-49.8倍;TXGD-B在三种介质中的溶解度可提升至本体药物PTX的86.9-97.4倍,显示糖基化策略可明显提高PTX的溶解性能;TXGDs均显示出低于PTX的脂水分配/分布系数,PTX经糖基化修饰后,其脂水分配/分布系数Log P与Log D均降至0-3范围内,处于较为合理的成药范围,显示糖基化策略可明显提高PTX的亲水性,使其更适于新药开发;TXGDs在胎牛血清和兔血清中均可部分释放出本体药物PTX,二者比较可知,TXGD-A在24 h后在胎牛血清和兔血清中分别可释放出17.57%与17.87%的PTX,其PTX释放率高于TXGD-B;TXGDs的药物设计参数计算结果表明PTX经糖基化修饰后,其药物设计参数可得到一定优化。从契合质量考虑,TXGD-A和TXGD-B针对人乳腺癌细胞的配体-受体契合质量FQ分别可提升至0.225和0.246,针对人卵巢癌细胞的FQ则分别提升至0.314与0.296,均优于本体药物PTX。从亲脂性和配体的亲和力考虑,TXGD-A与TXGD-B针对人乳腺癌细胞的亲脂性配体效率LELP分别可降低至72.860和57.144,针对人卵巢癌细胞的LELP则分别降至52.200与47.616,亦优于本体药物PTX;TXGD-A在纯水及临床用注射介质中的溶解度受pH影响,其溶解度在pH 9-10环境中得到提升,但在pH 1-8的环境中可保持在约16-20 μg/mL区间,并不出现明显波动,提示TXGD-A在人体内不会因为不同组织内环境pH不同导致药物在体内组织中出现浓度的异常波动;溶剂系统筛选结果指出,TXGD-A的溶解度在无酒精的低Cremophor EL比例增溶系统中具备良好的溶解性能,在Cremophor EL比例2.5%的无酒精溶剂系统中溶解度可达806.67 μg/mL,提示TXGD-A在潜在临床应用中可降低毒性增溶剂的使用比例,降低患者因增溶剂毒性出现不良反应的概率,显示出一定的临床开发应用价值。综上所述,糖基化策略可改善PTX溶解度、亲水性及药物设计参数等多种不足,是一种可行的PTX修饰策略。TXGD-A既能加强PTX与GLUT-1的互作结合,从而促使肿瘤细胞对药物进行摄取,又能有效降低溶剂中毒性增溶剂的用量,提示PTX经糖基化修饰后可借助GLUT-1的转运作用增加肿瘤细胞对药物的摄取,TXGD-A具有作为PTX衍生物进行二次开发的前景。