五味子多糖对疲劳的改善作用以及其代谢机制的探究

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研究目的:本实验分别以运动性疲劳与慢性疲劳综合征(Chronic fatigue syndromes,CFS)为动物模型,探究运动性疲劳与慢性疲劳综合症对机体的影响,并通过补充五味子多糖(Schisandra chinensls Polysaccharide, SCP)对动物机体抗两种疲劳的调节改善作用。初步阐述了运动性疲劳与慢性疲劳综合症对机体运动能力的影响,也为日后开发SCP的药用价值提供实验依据。研究方法:1)通过水提醇沉法得到五味子粗多糖,再通过纤维素(DEAE-52)与葡聚糖凝胶柱层析分级与纯化得到五味子多糖纯品(SCP),并对其理化性质进行鉴定,包括总糖含量和蛋白含量测定,紫外与红外图谱分析、单糖组成与氨基酸组成分析,以及利用环境扫描电镜和原子力电子显微镜对SCP进行了分子形貌的观察。2)通过对小鼠进行连续五周的游泳训练,建立运动性疲劳模型,并设立对照组研究SCP对运动性疲劳的影响。抗疲劳测试指标包括体重,力竭游泳时间与生化指标,包括:血乳酸、肝糖原、肌糖原、肌酸激酶(CK)、血清尿素氮(BUN)3)建立4周的多因素诱导的大鼠CFS模型,检验模型成功后进入治疗阶段并测定动物行为学方面的指标以及采集力竭运动后动物的尿液,利用气相质谱法(GC-TOF-MS)对动物尿液样本进行对比与鉴定。动物行为学指标分别为体重、摄饮量、进食量、水迷宫实验、悬尾实验、旷场实验;尿液代谢分析指标分别为尿常规指标对比、总离子图分析、主成分(PCA)分析、正交偏最小二乘法(OLPS-DA)分析、差异代谢物的筛选及鉴定。研究结果:1)SCP,其糖含量为58%;紫外图谱显示SCP波长在280nm左右有较强吸收峰,表明SCP属于蛋白多糖,红外图谱提示SCP属于α构型;单糖组成成分分析中,测得五味子多糖的单糖组成分别为甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其摩尔比为甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1:1.35:3.68;氨基酸含量结果为:SCP氨基酸成分有12种(ug/mg):Ala、Tyr、Glu、Phe、Val、Arg、Lys、His、Ser、Ile、Gly、Asp,SCP的蛋白质总量为4.53%;通过环境扫描电子显微镜与原子力电子显微镜观察到SCP由不规则的小型颗粒呈棉絮状聚集,固体无定型结构,分子间相对离散。2)五味子多糖抗运动性疲劳的研究中,SCP高剂量组大鼠的力竭游泳时间较对照组有显著性差异(P<0.05),说明高剂量的SCP对小鼠力竭疲劳时间有延缓作用;力竭即刻,SCP低、高剂量组小鼠的血乳酸、CK、BUN含量较安静组与对照组均不同程度的下降,呈显著差异性(P<0.05,P<0.01),肝糖原和肌糖原四组小鼠并无显著性差异(P>0.05);在组内对比中,各组小鼠在力竭恢复24h后机体的血乳酸、肝糖原、肌糖原与CK含量均有所恢复,并呈显著性差异(P<0.05,P<0.01),且SCP高剂量组小鼠体内BUN含量的恢复程度较其他三组较为显著(P<0.05)。3)SCP对慢性疲劳综合症的影响及代谢机制的研究中,CFS组大鼠的神萎靡、皮肤松弛等现象较安静组有显著性差异(P<0.05),SCP干预后,一般情况分值有所减少(分值越高,精神状况越差),且呈显著差异性(P<0.05);CFS组大鼠的日均摄食量和体重增长均显著性低于安静组(P<0.05),饮水量无显著性差异(P>0.05),SCP治疗后,摄食量与体重增长速度显著高于CFS组(P<0.05),饮水量无显著差异性(P>0.05);在水迷宫实验中,CFS组在原平台所在位置的周围活动路程与活动时间均小于安静组(P<0.05,P<0.01),穿台次数上无显著差异性(P>0.05),SCP组在周围活动路程周围活动时间与穿台次数上较CFS组呈显著性差异(P<0.05,P<0.01);在矿场实验中,CFS组大鼠在矿场场箱中所经路程、速度、站立次数均显著性低于安静组(P<0.05,P<0.01),修饰次数高于安静组(P<0.05),SCP组大鼠在矿场实验中的四个指标(总路程、平均速度、站立次数与修饰次数)与CFS组均呈现显著差异性(P<0.05);悬尾实验中,三组大鼠的挣扎次数无显著性差异(P>0.05),静止时间(即绝望状态)上,CFS组高于安静组(P<0.05),SCP组低于CFS组(P<0.05);尿常规结果显示CFS组与安静组URO、GLU、WBC呈现极显著性差异(P<0.01),PRO、BLD、呈现显著性差异(P<0.05),SCP治疗组与CFS组WBC呈现极显著性差异(P<0.01),URO、 GLU、PRO、BLD呈现显著性差异(P<0.05),BIL均未呈现显著性差异(P>0.05)。4)对三组大鼠力竭运动后的尿液进行采集与代谢组学分析,PCA的二维图结果显示安静组与CFS组尿液样品分离趋势明显,但有交叉重叠现象,CFS组与SCP组的样品分离趋势显著,无交叉重叠现象,且分散程度不一;OPLS-DA的进一步分析,三维图结果显示三组尿液样品彼此分离,无交叉重叠现象,安静组与CFS、CFS组与SCP组的对比结果为两组之间各组分离又自集,与PCA显示结果一致,同时,通过载荷图发现代谢差异物的分布;最终的代谢差异物筛选与鉴定结果中,CFS与安静组尿液样品显著上升的差异物有10种:显著上升的有苹果酸、延胡索酸、棕榈酸、中康酸、鞘氨醇;显著下降的有a-酮戊二酸、葡萄糖酸、丙二酸、羟基孕烯醇酮和莽草酸。这些差异物主要涉及三羧酸(TCA cycle)通路,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸合成代谢,鞘脂代谢与甾体激素生物合成代谢;无氧运动刺后慢性疲劳组(CFS)与SCP治愈组的尿液代谢物样品对比后,共得出7个变量:下调的有苹果酸、延胡索酸、庚二酸、苯基乳酸,上调的有肌酸、莽草酸与谷氨酰胺。这些化合物主要参与三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢和精氨酸、脯氨酸代谢。研究结论:1)SCP对力竭即刻机体血乳酸升高具有抑制作用,加快运动后肌糖原、肝糖原的恢复速度,具有明显的抗疲劳作用,还可以降低机体血清CK活性,抵制BUN的产生,缓解疲劳的发生,延长小鼠力竭游泳时间;2)通过运动、束缚、拥挤等干预手段会使大鼠产生精神萎靡、体重降低、空间探索能力记忆力与运动能力减弱的慢性疲劳症状,此造模方法能够模拟人类疲劳的内外环境,造成与人类相似的慢性疲劳综合症症状,SCP的补给能使大鼠体重升高、空间探索能力、记忆力与运动能力加强。3)通过GC-TOF-MC技术对CFS大鼠尿液代谢差异物的研究,找到慢疲劳综合征的发生与三羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢,鞘脂代谢与甾体激素生物代谢有关,且SCP改善CFS的途径是通过苹果酸和延胡索酸等调节三羧酸循环,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢通路来改善慢性疲劳综合症,对于预防和改善人体慢性疲劳综合症的机制具有一定启发,但还需进一步的研究。
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