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目的:观察原花青素对白细胞介素-1beta(interleukin-1beta,IL-1?)诱导的软骨细胞凋亡的影响,从而探讨原花青素在保护软骨细胞方面的作用。方法:1.在无菌的环境下取6周龄昆明小鼠膝关节处软骨组织,剪碎成泥,用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化6小时至软骨组织基本消失,消化完成后,用200目钢网过滤,离心后重悬至含有10%胎牛血清的细胞培养液中。接种于60mm培养皿中,然后放于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。2.取原代软骨细胞铺板,当细胞贴壁并且基本长满后,用原花青素终浓度为0、0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000mg/ml每孔,IL-1?终浓度为10μg/L的无血清细胞培养液分别培养软骨24小时,然后采用MTT法用酶标仪检测细胞存活率,并且获得原花青素的最适药物浓度。3.取原代软骨细胞铺板,当细胞贴壁并且基本长满后,将细胞分为三组。溶剂对照组不加药只加无血清培养液,凋亡组加入IL-1?终浓度为10μg/L的无血清细胞培养液,给药组加入IL-1?终浓度为10μg/L和原花青素终浓度为0.050mg/ml(MTT法测出)的无血清培养液,24小时后加载荧光探针DCFH-DA用酶标仪检测细胞内活性氧自由基的含量。4.取第一代软骨细胞分三组,溶剂对照组不加药只加无血清培养液,凋亡组加入IL-1?终浓度为10μg/L的无血清细胞培养液,给药组加入IL-1?终浓度为10μg/L和原花青素终浓度为0.050mg/ml的无血清培养液。孵育24小时之后,加载JC-1探针,用酶标仪检测线粒体膜电位。5.取第一代软骨细胞,分为三组,溶剂对照组不加药只加无血清培养液,凋亡组加入IL-1?终浓度为10μg/L的无血清细胞培养液,给药组加入IL-1?终浓度为10μg/L和原花青素终浓度为0.050mg/ml的无血清培养液。24小时之后,去除上清液,加入胰酶消化细胞,用Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V-FITC和PI后,用流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡率。6.取第一代软骨细胞,分为三组,溶剂对照组不加药只加无血清培养液,凋亡组加入IL-1?终浓度为10μg/L的无血清细胞培养液,给药组加入IL-1?终浓度为10μg/L和原花青素终浓度为0.050mg/ml的无血清培养液。。24小时之后,去除上清液,加入胰酶消化细胞,用无血清细胞培养液洗细胞两次,2000r/min 5分钟离心沉淀细胞,加戊二醛固定,送至大连医科大学电镜室做超薄切片并用电子显微镜观察。结果:1.在倒置相差显微镜下观察,软骨细胞在刚刚接种的时候成透明的圆形。1-2天之后贴壁,软骨的形态为三角形、多边形或者不规则型。当软骨细胞成片生长时,呈现的形态为“铺路石样”。2.MTT实验结果显示,原花青素对IL-1?介导的软骨细胞凋亡有一定的抑制作用,在药物浓度为0.005mg/ml,0.010mg/ml,0.050mg/ml,0.100mg/ml,0.500mg/ml,1.000mg/ml的时候差异有统计学意义(P<0.05),其中,在原花青素浓度达到0.050mg/ml的时候细胞存活率达到最大值,切与浓度为0.010mg/ml、0.100mg/ml的时候相比差异均有统计学意义(P<0.05)。0.050mg/ml被选用成为接下来的实验中所加入的原花青素的药物浓度。3.在利用荧光探针DCFH-DA进行的实验中,实验结果显示,IL-1?作用于原代提取的软骨细胞会使细胞内的活性氧自由基的水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而原花青素对IL-1?诱导的软骨细胞内的ROS水平有一定的降低作用,差异有统计学意义(P<0.05)。4.在利用JC-1探针的实验中,检测结果显示,凋亡组与溶剂对照组相比,绿色荧光强度与红色荧光强度的比值明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。给药组与凋亡组相比,绿色荧光强度与红色荧光强度的比值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。5.Annexin V-FITC/PI实验流式细胞仪结果显示凋亡组细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率相对于溶剂对照组均明显升高(P<0.05);给药组细胞的早期凋亡率相对于凋亡组明显降低(P<0.05),晚期凋亡率相对于凋亡组降低(P>0.05)。6.电子显微镜的观察显示在溶剂对照组中软骨细胞细胞增殖活跃,细胞形态正常。在凋亡组中细胞呈凋亡状态。在给药组中软骨细胞凋亡状态有所缓和。结论:原花青素能够抑制IL-1?诱导的软骨细胞凋亡。