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目的建立以真核表达载体介导的过表达TIMP-3基因的肝癌细胞株（SMMC-7721和HepG2），研究TIMP-3基因对两肝癌细胞增殖、凋亡、生长周期、侵袭、迁移等细胞生物学功能的影响。方法1.研究质粒pCMV6-AC-GFP/TIMP-3（TIMP-3）和阴性对照质粒pCMV6-AC-GFP（NC）的扩增和鉴定：把TIMP-3质粒和NC质粒稀释后转化入大肠杆菌中扩增，测序鉴定后提取纯净无内毒素的TIMP-3质粒和NC质粒，用于后续实验。2.用扩增后的TIMP-3质粒和NC质粒分别转染两肝癌细胞株，因用800μg/mlG418连续筛选2周后，NC组细胞均死亡，故降低G418浓度至400μg/ml继续筛选2周，成功构建阳性单细胞克隆，用Western Blot技术检测细胞中TIMP-3蛋白表达。3.利用MTS增殖实验绘制细胞生长曲线，检测TIMP-3基因稳定表达后肝癌细胞的生长情况。4.利用流式细胞仪检测TIMP-3基因稳定表达后的肝癌细胞凋亡和细胞周期变化情况。5.利用Transwell小室细胞侵袭实验和迁移实验检测TIMP-3基因稳定表达后的肝癌细胞侵袭能力和迁移能力变化。结果1.TIMP-3质粒和NC质粒成功转至大肠杆菌中，与原始序列进行比对，结果完全一致，可用于后续实验。2.利用非脂质体转染试剂把TIMP-3质粒和NC质粒分别转染两肝癌细胞株，得到稳定高表达TIMP-3的单克隆阳性细胞株。命名为TIMP-3组SMMC-7721及HepG2细胞，而稳定转染空载的细胞命名为空白对照组SMMC-7721及HepG2细胞。经Western blot证实TIMP-3组细胞表达TIMP-3蛋白，而NC组细胞则没有TIMP-3蛋白表达。3.MTS实验检测显示TIMP-3组SMMC-7721及HepG2细胞增殖力显著弱于NC组（P<0.05）。4.流式细胞术显示TIMP-3诱导两肝癌细胞发生凋亡(SMMC-7721：30.7±1.6%vs8.4±1.1%，P=0.001；HepG2：12.6±1.1%vs7.6±1.3%，P=0.038）和产生G2/M期阻滞[SMMC-7721：（G0/G1期：(36.075±3.53)%vs(57.72±1.53)%，G2/M期：(51.91±1.71)%vs (30.11±0.20)%，P=0.030）；HepG2：（G0/G1期：(49.82±1.46)%vs(59.47±1.27)%，G2/M期：(26.27±0.54)%vs(14.15±3.6)%，P=0.034）]。5.体外侵袭实验显示TIMP-3使两肝癌细胞的侵袭能力显著降低（SMMC-7721：60±11vs121±17，P=0.033；HepG2：98±6vs192±22，P=0.015）；体外迁移实验显示TIMP-3使两肝癌细胞的迁移能力显著降低（SMMC-7721：53±8vs102±10，P=0.038；HepG2：109±9vs232±13，P=0.001）。结论1．通过稳定转染，构建稳定表达TIMP-3蛋白的两肝癌细胞株。2．与NC组比较，TIMP-3基因能显著抑制两肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞，并抑制细胞的侵袭和迁移能力。