论文部分内容阅读
目的:腺苷即腺嘌呤核苷,来源于体内腺嘌呤核苷酸,主要由5’-核苷酸酶催化AMP生成,机体内分布广泛,介导诸多生物体内诸多生理作用,影响着机体内不同细胞的病理和生理过程。腺苷扮演着多种酶反应和细胞生命活动所需的辅助因子的组成部分,通过与其相应的受体结合来实现其生物学效应。腺苷受体(adenosine receptors ARs)是G蛋白耦联受体家族成员之一,包括四种亚型:A1,A2a,A2b和A3,在脑组织内广泛表达。既往研究表明腺苷在中枢神经系统中是一种重要的内源性神经调质,且脑出血(intracerebral hemorrhage ICH)发生后被大量释放。因此,本实验旨在确定脑出血后各亚型腺苷受体表达变化并进一步明确腺苷受体在脑出血后继发性脑损伤(secondary brain injury SBI)中的作用和相关机制。方法:在Sprague-Dawley大鼠体内建立胶原酶诱导的脑出血模型,将培养的原代大鼠皮质神经元暴露于浓度为10μM的氧合血红蛋白看以模拟体外ICH。首先,ICH建模后,在不同时间点将大鼠处死并用PBS灌注取脑(6小时,12小时,24小时,48小时,72小时和1周)。蛋白质印迹(Western-blot)法在体内和体外实验中分析ICH后各亚型腺苷受体的表达变化,免疫荧光共染法(immunofluorescence staining)进行确认,选择变化显著的受体类型进行下一步的干预(本实验结果提示A1腺苷受体表达水平变化最大)。然后,使用A1腺苷受体激动剂N(6)-环己基腺苷(R-PIA)和拮抗剂8-苯基-1,3-二丙基黄嘌呤(8-PT)进行干预,通过Western-blot检测干预后A1腺苷受体、活性caspase-3和白蛋白的蛋白质水平的变化,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling TUNEL)染色及Fluoro-Jade B(FJB)染色来观察干预后神经细胞的变性和凋亡,并测定脑组织含水量进行脑水肿检测,最终明确A1腺苷受体在ICH后继发性脑损伤中的作用。最后,为进一步研究A1AR在ICH后继发性脑损伤中的作用,通过蛋白质印迹分析测试磷酸化的ERK,p38,JNK以及MAPKAP2和Hsp27的磷酸化水平即活化情况,再使用P38拮抗剂(SB203580)和Hsp27(KNK437)的拮抗剂进行干预,通过Western-blot观察通路相关的各蛋白水平变化,用TUNEL染色、FJB染色及伊文思蓝(EB)来评估P38拮抗剂和Hsp27拮抗剂干预后脑损伤指标:神经元变性凋亡和血脑屏障(blood-brain-barrier BBB)的渗透性,最终推断A1腺苷受体在脑出血后脑保护作用的相关机制。结果:A1腺苷受体的蛋白水平在ICH情况下显著增加,而其它3种腺苷受体的蛋白水平没有显著变化。此外,在ICH情况下,激动剂R-PIA可上调A1腺苷受体的表达,而拮抗剂8-PT可降低其表达。A1腺苷受体激活后抑制了皮质下的神经元变性凋亡、具有显著的神经保护作用,表现为TUNEL、FJB阳性率及活性caspase-3、白蛋白表达量显著降低,而这些与P38,MAPK,MAPKAP2和Hsp27的磷酸化水平增加相关。当A1腺苷受体被抑制后,导致了与上述相反的效果,即神经元变性凋亡增多、脑损伤加重。最后,机制研究中的实验结果显示被P38和Hsp27被各自的拮抗剂阻断时,A1腺苷受体激动剂R-PIA的神经保护作用可被抑制,揭示了A1腺苷受体神经保护作用的潜在机制是通过激活P38-MAPKAP2-Hsp27通路实现的。结论:这项研究表明,ICH后A1腺苷受体的表达明显上调,被其激动剂R-PIA激活的A1腺苷受体可以通过P38-MAPKAP2-Hsp27通路降低大鼠脑出血后继发性脑损伤。