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研究背景在牙周组织(牙龈、牙周韧带、牙槽骨和牙骨质)发生的各种各样的疾病称之为牙周疾病[1]。它是两大类口腔疾病之一,在世界各地盛行。在我国,其发病率高于龋病。此外我国正进入老龄化社会，牙周病的防治更受学者们关注。牙槽骨是牙周重要支持组织，与牙龈、牙周膜和牙骨质维持牙齿。牙槽骨吸收是牙周炎重要病理变化之一，它使得牙齿的支持组织丧失，牙齿逐步松动，最后脱落或被拔除，严重影响患者的咀嚼功效及美观。所以，针对骨吸收控制的试验及临床研究在不断深入。骨吸收主要是破骨细胞骨造成的吸收(破骨细胞,OC)。近年来破骨细胞的作用研究受到一系列因素调节,如IL-6、IL-1TNF和PGE2和淋巴毒素等因素，牙周病牙菌斑中的细菌释放的脂多糖可以刺激免疫细胞和成骨细胞释放炎性介质,然后这些炎性介质可以激活巨噬细胞和成纤维细胞而分泌细胞因子,大量的破骨细胞被诱导形成最终导致牙槽骨吸收。OPG/RANK/RANKL系统是近年来研究发现的调节破骨细胞形成和活化的重要因素。牙周病变能促进多种细胞因子活性的骨吸收，虽然OC和协同激活的形成，但RANKL表达的局部变化是直接推动和OC关键激活的形成[2]。实验研究证实，在牙槽骨局部骨吸收过程中RANKL表达增加，活动期牙周炎患者RANKL/OPG比率上升[3]。牙周膜成纤维细胞(牙周韧带细胞,PDLFs)是最重要的一类细胞,是重要的牙周膜间充质细胞，在牙周组织中发挥着重要的生理和病理作用,成骨细胞表型可以表达OPG和RANKL mRNA,双向调节破骨细胞分化[4]。在抑制骨吸收的药物研究中，中药以其副作用小而受到关注。滋阴补肾的六味地黄丸,它有助于促进骨骼生长,源于宋朝钱乙《小儿药症直诀》,最初治疗肾虚生骨慢的孩子的“囟开不合”。现代研究证实骨中钙磷代谢可由其调节,另外六味地黄丸可以促进骨折愈合。近年来，许多补肾固齿中药是由六味地黄丸加减而成的。有研究说明了六味地黄汤可以抑制烫伤后大鼠腹腔巨噬细胞的TNF分泌并且降低血清中IL-6水平，调节人体的免疫功能[5]。IL-1和PGE2参与的炎症过程，可能会影响RANKL的表达和功能[6]。六味地黄丸的表达是通过其抗炎作用抑制RANKL和抑制骨吸收和骨形成，到目前为止没有这样的报告。所以本实验从OPG/RANK/RANKL系统入手研究六味地黄丸对牙槽骨吸收作用的分子机理，有利于深入探讨中医学“补肾固齿”理论的实质，同时为中药治疗牙周炎牙槽骨吸收提供一定的实验依据，对牙周病的防治将具有重要意义。目的1研究六味地黄丸作用下人牙周膜成纤维细胞的增殖及细胞OPG/RANKL表达的情况。2研究六味地黄丸作用下对IL-1β、TNF-α干预后的人牙周膜成纤维细胞增殖及OPG/RANKL表达的影响。3探讨中医学“补肾固齿”理论实质。方法1人牙周膜成纤维细胞由酶消组织块法培养得到，传代培养后绘制细胞生长曲线，经免疫组化法鉴定细胞的来源。2利用噻唑盐（MTT）法检测六味地黄丸对IL-1β、TNF-α干预下人牙周膜细胞增殖的影响。3IL-1β、TNF-α作用后六味地黄丸对人牙周膜成纤维细胞OPG/RANKL表达的影响用免疫组织化学法来测定。结果1原代、传代培养的人牙周膜成纤维细胞成功获得，经免疫组化方法鉴定证明细胞来源于间充质并得到其增长曲线图。2利用MTT法，结果：当水提液浓度由0.001mg/ml增加到0.1mg/ml时，随着药物浓度的增加药物对hPDLFs增殖的促进作用逐渐增加，且随时间增加（1-4天）促进幅度增大，差异有统计学意义（P<0.05）；但药物从1mg/ml变化至10mg/ml时对细胞有抑制作用，分析发现差异有统计学意义（P<0.05）。IL-1β组和IL-1β+六味地黄丸组比，所得值后者比较高，差异有统计学意义（P<0.05）；TNF-α+六味地黄丸组与TNF-α组比较，前者在各时间点OD值均高于后者，差异有统计学意义（P<0.05）。3免疫组化结果显示：六味地黄丸水组与正常细胞组相比，药物干预组OPG表达测量值高于对照组，而RANKL表达测量值低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；IL-1β+六味地黄丸组与IL-1β组、TNF-α+六味地黄丸组与TNF-α组比较，添加六味地黄丸组OPG表达测量值高于不添加组，RANKL蛋白表达测量值低于不添加组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论1六味地黄丸水提液在适当浓度范围刺激hPDLFs增殖。2六味地黄丸水提液不仅能改善IL-1β、TNF-α对hPDLFs增殖的抑制作用，并且可以使IL-1β、TNF-α作用后的hPDLFs中OPG表达增加，同时RANKL的表达降低。3IL-1β、TNF-α对人牙周膜细胞增殖的抑制作用可被六味地黄丸改善，从而减轻炎症；另外细胞RANKL表达被下调、OPG表达被上调，通过对此系统的调节而抑制牙槽骨吸收。进而可以得出结论是，中药可以通过抑制炎症因子对OPG/RANK/RANKL系统的作用来达到“补肾固齿”的效果。这就为中医学“补肾固齿”理论提供重要实验依据，也为中药治疗牙周炎牙槽骨吸收提供基础理论依据。