论文部分内容阅读
真菌毒素是部分真菌在适宜的环境条件下产生的对人或牲畜具有毒害作用的次级代谢产物,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是一种主要由镰刀菌所产生的代谢产物,属于真菌毒素的一种。DON广泛存在于被镰刀菌污染的粮食及其制品中,不易分解且具有毒害作用,被人类或牲畜食用后容易引发呕吐和胃肠道疾病,食用过量时会造成生物体肝脏和肾脏的损伤。因此,建立快速有效的粮食作物及相关产品中DON检测技术对于避免人畜误食、保证食品安全具有重要意义。目前国内外的研究人员为构建切实可行且高效低成本的DON检测方法开展了一系列研究。但目前所应用的检测方法仍存在成本高、检测试剂对人体有毒害等不足,因此本研究针对现有问题基于磁小体表面展示技术建立了一种低成本、高效率且无毒无害的DON微量检测富集体系。
细菌磁小体(Bacterial magnetosomes,BMs)是一类由趋磁细菌在体内合成的具有磁力效应的磁性纳米颗粒。磁小体表面覆盖有生物质膜,这不仅使其化学性质更加稳定,且为磁小体表面功能基团偶联提供了大量修饰位点。此外,磁小体还具有形态大小一致、分散性良好的优点。本研究通过利用磁小体作为纳米磁性载体,将DON特异性识别材料通过化学交联剂修饰到磁小体表面,构建了一种能够对DON进行微量检测并富集回收的检测系统。
本研究首先利用4.5L发酵罐对趋磁细菌进行发酵培养,并利用超声破碎及磁吸附进行磁小体的分离纯化。随后,分别利用戊二醛和聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)将可特异性识别DON的DNA单链序列——核酸适配体连接于磁小体表面,并分别对连接及吸附条件进行优化,构建了一套利用磁小体表面展示技术对DON进行磁性富集吸附的检测体系。体系优化结果表明:以戊二醛作为交联剂时,1 mg BMs所连接的适配体最佳用量为0.1 nmol,交联剂戊二醛最佳使用浓度为5%,戊二醛修饰磁小体一次时制备的复合物对DON的吸附率最高。以最佳条件制备的1 mg BMs-戊二醛-aptamer复合物对于DON的吸附率达到18.16%,绝对吸附量为 27.24 ng。以不同的方法对磁小体复合物吸附的DON进行洗脱时,结果为DNA酶+纯甲醇(2次)的洗脱率最高,为72.7%。以PEI作为交联剂时,1 mg BMs所连接的适配体最佳用量为1 nmol,交联剂PEI最佳使用量为5 mg,PEI修饰磁小体一次时制备的复合物对DON的吸附率最高。以最佳条件制备的1 mg BMs-PEI-aptamer吸附剂对DON的吸附率为18.43%,绝对吸附量为 27.64 ng。以不同的方法对磁小体复合物吸附的DON进行洗脱时,结果为DNA酶+纯甲醇(2次)的洗脱率最高,为64.1%。
由上述结果可知:当以戊二醛作为交联剂时,优化条件所制备的复合体其对于DON的吸附率为18.16%,绝对吸附量为 27.24 ng。当以PEI作为交联剂时,优化条件所制备的复合体其对于DON的吸附率为18.43%,绝对吸附量为27.64 ng。实验证明,戊二醛及PEI这两种交联剂均能将特异性识别DON的核酸适配体修饰于磁小体表面,且制备的两种磁性复合物均能有效的吸附DON,与当前国内外对于磁性颗粒吸附DON的绝对吸附量研究结果基本一致,但相对于人工纳米磁颗粒,磁小体合成条件温和环保,不需进行后续表面包埋修饰因而复合体构建方法简单。本研究建立的DON检测体系不仅能对待测样品中微量DON进行精确定量检测,且研究成果进一步丰富了磁小体在真菌毒素检测方面的应用研究,为类似研究的开展提供了理论参考与依据。此外,经固定化等途径改造后还可利用磁小体磁性对样品中呕吐毒素进行富集去除,为后续基于该复合体建立样品中DON毒素脱除体系奠定基础。
细菌磁小体(Bacterial magnetosomes,BMs)是一类由趋磁细菌在体内合成的具有磁力效应的磁性纳米颗粒。磁小体表面覆盖有生物质膜,这不仅使其化学性质更加稳定,且为磁小体表面功能基团偶联提供了大量修饰位点。此外,磁小体还具有形态大小一致、分散性良好的优点。本研究通过利用磁小体作为纳米磁性载体,将DON特异性识别材料通过化学交联剂修饰到磁小体表面,构建了一种能够对DON进行微量检测并富集回收的检测系统。
本研究首先利用4.5L发酵罐对趋磁细菌进行发酵培养,并利用超声破碎及磁吸附进行磁小体的分离纯化。随后,分别利用戊二醛和聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)将可特异性识别DON的DNA单链序列——核酸适配体连接于磁小体表面,并分别对连接及吸附条件进行优化,构建了一套利用磁小体表面展示技术对DON进行磁性富集吸附的检测体系。体系优化结果表明:以戊二醛作为交联剂时,1 mg BMs所连接的适配体最佳用量为0.1 nmol,交联剂戊二醛最佳使用浓度为5%,戊二醛修饰磁小体一次时制备的复合物对DON的吸附率最高。以最佳条件制备的1 mg BMs-戊二醛-aptamer复合物对于DON的吸附率达到18.16%,绝对吸附量为 27.24 ng。以不同的方法对磁小体复合物吸附的DON进行洗脱时,结果为DNA酶+纯甲醇(2次)的洗脱率最高,为72.7%。以PEI作为交联剂时,1 mg BMs所连接的适配体最佳用量为1 nmol,交联剂PEI最佳使用量为5 mg,PEI修饰磁小体一次时制备的复合物对DON的吸附率最高。以最佳条件制备的1 mg BMs-PEI-aptamer吸附剂对DON的吸附率为18.43%,绝对吸附量为 27.64 ng。以不同的方法对磁小体复合物吸附的DON进行洗脱时,结果为DNA酶+纯甲醇(2次)的洗脱率最高,为64.1%。
由上述结果可知:当以戊二醛作为交联剂时,优化条件所制备的复合体其对于DON的吸附率为18.16%,绝对吸附量为 27.24 ng。当以PEI作为交联剂时,优化条件所制备的复合体其对于DON的吸附率为18.43%,绝对吸附量为27.64 ng。实验证明,戊二醛及PEI这两种交联剂均能将特异性识别DON的核酸适配体修饰于磁小体表面,且制备的两种磁性复合物均能有效的吸附DON,与当前国内外对于磁性颗粒吸附DON的绝对吸附量研究结果基本一致,但相对于人工纳米磁颗粒,磁小体合成条件温和环保,不需进行后续表面包埋修饰因而复合体构建方法简单。本研究建立的DON检测体系不仅能对待测样品中微量DON进行精确定量检测,且研究成果进一步丰富了磁小体在真菌毒素检测方面的应用研究,为类似研究的开展提供了理论参考与依据。此外,经固定化等途径改造后还可利用磁小体磁性对样品中呕吐毒素进行富集去除,为后续基于该复合体建立样品中DON毒素脱除体系奠定基础。