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肺癌已是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌中70%为NSCLC(非小细胞肺癌)。化学治疗是肺癌支柱疗法之一。紫杉醇作为抗细胞微管结构的抗肿瘤药物,无论是单药还是联合用药均显示出良好的抗肿瘤活性,已是晚期非小细胞肺癌的一线用药。但研究表明紫杉醇单药的治疗有效率不及30%,联合靶向治疗有效率可提高至50%左右,可见仍有约50-70%的肺癌患者无法从紫杉醇治疗中获益,究其失败原因,紫杉醇的原发耐药和继发耐药是关键。探究紫杉醇耐药的新机制,发现新的耐药关键因子,对突破限制紫杉醇广泛应用的瓶颈具有重要科学意义。Six家族,即同源异型盒基因家族,Six家族基因的发生突变或表达异常在肿瘤的增殖、迁移和转移的发生的过程中起着重要作用。Six1作为Six超家族重要的成员,同样具有癌基因特性,在多种肿瘤组织中过表达,包括乳腺癌,横纹肌肉瘤,肝细胞癌,卵巢癌和肾母细胞瘤、结直肠癌等,并且参与其发生、发展过程。但Six1在非小细胞肺癌中恶性生物学行为和紫杉醇耐药的相关性研究较少。乙酰化是生物体内普遍进行的反应,最常见的是组蛋白乙酰化。Kat,赖氨酸乙酰基转移酶(lysine acetyltransferase,Kat),又称组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyl transferase,HAT),是乙酰化重要的功能蛋白酶。Kat7作为组蛋白乙酰基转移酶的亚基,广泛参与染色体的结构修饰和基因表达调控,从而影响细胞内的复杂的生物学功能,如DNA的损伤修复和细胞凋亡。Kat7已成为近年来的研究热点,尤其在乳腺癌、胃癌、卵巢癌的相关研究中,过表达的Kat7参与肿瘤的恶性生物学行为。然而,Kat7在非小细胞肺癌中的作用,以及Kat7与肿瘤耐药之间的研究还未曾报道。本实验拟以新因子Six1和kat7为研究对象,进一步验证其在非小细胞肺癌中的恶性生物学行为及紫杉醇耐药机制。实验目的寻找调控紫杉醇耐药过程中的新分子,研究其生物行为并探索其介导耐药的可能的相关分子机制,为提高临床中紫杉醇的化疗效率,降低耐药性的产生以及为新药研发提供新的方向和思路。实验方法通过诱导耐药的方法建立非小细胞肺癌A549紫杉醇耐药的细胞株。并应用基因芯片技术,比较已建立的紫杉醇耐药的A549细胞同对照细胞的基因表达谱差异,筛选出差异最大的两个基因Six1和Kat7,并利用Real-time PCR和Western blot方法进一步验证了 Six1和Kat7在耐药与非耐药细胞系中的表达差异。在确定了 Six1和Kat7为紫杉醇耐药细胞同非耐药细胞系的差异基因后,我们首先通过生长曲线、克隆形成实验、划痕实验、transwell实验了解这两个基因的生长、迁徙、侵袭等恶性生物学特性。之后为阐明Six1和Kat7介导紫杉醇耐药的机制,我们在体外实验中,利用不同非小细胞肺癌细胞系A549和Calu3给予敲低或过表达Six 1和Kat7干预后,通过流式细胞技术和线粒体ROS检测两条通路初步探究Six1和Kat7介导紫杉醇耐药的机制。同时进行体内实验,通过对表达不同Six1和Kat7水平的荷瘤小鼠进行紫杉醇药物干预后观察瘤体生长情况,在动物实验中进一步确认研究基因同耐药的关系。我们还将研究设想同临床相结合,总结45例非小细胞肺癌患者的临床资料进行统计,分析Six1和Kat7的表达情况与患者对紫杉醇敏感性以及预后的影响。实验结果生物学特性的研究结果:Six1和Kat7过表达促进肿瘤生长、增强肿瘤转移和侵袭能力,敲低Six1和Kat7后结果与之相反。介导紫衫顺耐药的机制研究结果:过表达Six1和Kat7,可增加非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的耐药性,反之,敲低Six1和Kat7增加其敏感性;Six1和Kat7介导ROS通路和细胞凋亡通路,导致紫杉醇耐药性增加的。体外实验中Six1和Kat7的表达水平,均与紫杉醇敏感性呈负相关,我们在动物模型中也得到了相同的结论。临床资料分析:Six1和Kat7在正常组织和非小细胞癌组织中表达差异明显,癌组织中明显高于正常组织。通过观察Six1的表达程度与临床预后的关系发现,Six1的表达越高,预后越差。结论1.Six1和Kat7具有癌基因相关特性。Six1和Kat7高表达会促进肿瘤生长,增强肿瘤转移及侵袭能力。Six1和Kat7成为潜在的调控非小细胞肺癌细胞侵袭转移的靶点,提供了有力支持。2.体外实验中我们证实了 Six1和Kat7可通过降低ROS水平以及抑制细胞凋亡而增加非小细胞肺癌细胞株对紫杉醇的耐药性。3.动物实验证明Six1和Kat7可以促进肿瘤生长,并且过表达的Six1和Kat7对紫杉醇产生了明显的耐药性,通过敲低Six1和Kat7表达可以恢复肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。4.临床资料显示Six1在正常组织和非小细胞癌组织中表达差异明显,癌组织中明显高于正常组织。通过观察Six1的表达程度与临床预后的关系发现,高表达患者与紫杉醇耐药息息相关,显示出不良预后,这种差异也是的Six1成为了潜在的治疗和新的预测靶点。