北冬虫夏草培养基优化及活性成分研究

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本文以北冬虫夏草菌为实验对象,以菌丝体干重为评价指标,系统的对北冬虫夏草菌的培养基配方进行优化,并分析北冬虫夏草菌的生长规律。对活性成分(Cu/Zn—SOD,北虫草多糖,虫草酸和9种核苷类物质)进行研究,研究内容如下:优化提取北冬虫夏草菌丝体中SOD工艺及鉴定携带的金属辅基类型;检测北冬虫夏草菌丝体中虫草多糖含量及验证其抗氧化活性;从北冬虫夏草菌丝体中提取虫草酸的工艺选择、提取工艺优化及虫草酸结构判定;采用基质固相分散提取法从北冬虫夏草菌丝体中提取9种核苷类物质,并采用高效液相色谱法同时测定尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、胞苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、虫草素的含量,结论如下:通过比较4种不同培养基配方培养菌丝体的菌球大小、发酵液澄清度、菌丝体干重三种指标,确定最佳培养基配方;运用数据拟合和数理统计分析的方法对碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)、无机盐A (K2HPO4).无机盐B (MgSO4·7H2O)四种因素进行单因素考察,并在此基础上建立L9(34)正交试验,确定最佳培养基配方中葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、MgSO4·7H2O添加量;利用紫外比浊法测定北冬虫夏草的生长曲线,得到最佳扩大培养接种种龄为72h。分别采用甲苯提取法、乙醇—氯仿提取法、分级沉淀法提取北冬虫夏草中SOD,结果表明分级沉淀法为最佳提取方法。以缓冲液与菌丝体的液料比、缓冲液的pH值、提取SOD所需时间三个条件的最佳工艺参数为基础,利用响应面软件进行试验设计,得到SOD的提取工艺参数。紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、原子吸收分光光度法鉴定北冬虫夏草中SOD为Cu/Zn-SOD。利用苯酚-硫酸法测定北冬虫夏草菌丝体中虫草多糖的含量。虫草多糖具有清除DPPH的能力,清除率为89%;虫草多糖具有清除·OH能力,清除率为93%;虫草多糖具有一定的还原能力;乙醇-微波协同提取法提取北冬虫夏草菌丝体中的虫草酸。以乙醇与菌丝体的液料比、乙醇浓度、提取时间、功率4个条件的最佳工艺参数为基础,进行Box-Behnken Design试验设计,获得有利于提取虫草酸工艺参数,紫外-可见分光光度法对待测物质的紫外光谱图与虫草酸标准物紫外光谱图进行比对,可推断出标准品与待测物质具有相同的化学式。选用基质固相分散提取法提取北冬虫夏草中核苷类物质,考察分散剂类型、分散剂与样品之比、洗涤溶剂类型、洗涤溶剂体积、洗脱溶剂类型对核苷类物质提取率的影响。高效液相色谱法同时测定北冬虫夏草菌丝体中尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、胞苷、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷、虫草素含量分别为187.6ug/g、802.5ug/g、333.6ug/g、256.0ug/g、95.9ug/g、262.5ug/g、17.3ug/g、311.2ug/g、250.0ug/g。
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