东方粘虫V-ATP酶a、d和C亚基的克隆、表达及多克隆抗体的制备

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hongmusong
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靶标的创新是新农药创制的基础,探究药物的作用靶标可以为新农药的创制提供思路,以天然产物为探针是发现新靶标的重要途径。东方粘虫(Mythimna separata)属鳞翅目夜蛾科,是禾本科作物的主要害虫。东方粘虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV)中有一种 V 型 H+-ATP 酶,通过水解 ATP 产生的能量形成质子跨膜梯度,进而调节细胞内的pH环境。近些年,已有越来越多的学者以V-ATP酶作为药物靶标进行了研究。本研究针对东方粘虫中肠V-ATP酶a、d和C亚基基因进行了克隆、原核表达与纯化以及多克隆抗体制备的研究。主要研究结果如下:利用RT-PCR和RACE技术成功克隆获得了东方粘虫V-ATP酶a亚基(MS-VATPa)基因的cDNA全长序列,该基因序列为3538 bp,包含121 bp的5’非编码区序列和905 bp的3’非编码区序列,开放阅读框为2511 bp,该开放阅读框的起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,翻译836个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为95.75 ku,预测等电点(pI)为6.01,预测编码蛋白含有8个跨膜区。通过序列同源性和系统进化树分析发现东方粘虫MS-VATPa氨基酸序列与鳞翅目天蛾科烟草天蛾(Maduca sexca)的同源性最高,为94%。GenBank录号为:KY921845。利用RT-PCR和RACE技术成功克隆获得了东方粘虫V-ATP酶d亚基(MS-VATPd)全长序列,该基因序列2236 bp,包含96bp的5’非编码区序列和1093 bp的3’非编码区序列,开放阅读框为1047 bp,该开放阅读框的起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,翻译348个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为39.59 ku,预测等电点(pI)为4.93。通过序列同源性和系统进化树分析得到东方粘虫中肠MS-VATPa氨基酸序列与鳞翅目蚕蛾科家蚕(Bombyxmori)的同源性最高,为96%。GenBank录号为:KY921847。利用RT-PCR和RACE技术成功克隆获得了东方粘虫V-ATP酶C亚基(MS-VATPC)基因的cDNA全长序列,该基因序列为1878 bp,包含116bp的5’非编码区序列和611 bp的3’非编码区序列,开放阅读框为1152 bp,该开放阅读框的起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,翻译383个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为43.75 ku,预测等电点(pI)为8.46。通过序列同源性和系统进化树分析得到东方粘虫中肠MS-VATPa氨基酸序列与鳞翅目菜蛾科小菜蛾(Plutella xyltellaa)的同源性最高,为88%。GenBank录号为:KY921846。将扩增的MS-VATPa、MS-VATPd和MS-VATPC基因编码区片段亚克隆于原核表达载体 pET-22b(+),构建了重组表达载体 pET22b-MS-VATPa、pET22b-MS-VATPd 和pET22b-MS-VATPC,并转化至E.coliBL21(DE3)中,利用不同浓度的IPTG(终浓度为0.3 mmol/L,0.6 mmol/L,0.9 mmol/L)诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot印迹检测,结果表明成功表达出相对分子量分别约为96.6 ku、40.4 ku 和 44.6 ku 的 MS-VATPa、MS-VATPd 和 MS-VATPC 融合蛋白。以MS-VATPd和MS-VATPC蛋白为抗原,免疫注射BALB/C小鼠。利用ELISA法检测抗血清的效价,结果显示鼠抗MS-VATPd抗体和鼠抗MS-VATPC抗体的效价分别为1:4,000和1:256,000;利用Weatern Blot检测鼠抗MS-VATPC血清的结果显示在相对分子质量约44.6 ku处有一条明显的阳性条带,与理论相对分子量基本一致。这表明制备的鼠抗MS-VATPd多克隆抗体的效价相对较低,而MS-VATPC多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性。综上所述,本研究成功克隆了东方粘虫V-ATP酶a、d和C亚基cDNA全长序列,分别构建了这三个基因的原核表达体系,实现了异源基因在大肠杆菌中的可溶性表达,并制备了特异性好、效价高的鼠抗MS-VATPC多克隆抗体。这一研究结果为进一步探究它们在昆虫体内的生物学功能,特别是其在东方粘虫V-ATP酶V0V1可逆的解离与组装过程中的作用,药物与V-ATP酶的分子作用机制以及基于MS-VATPa、MS-VATPd和MS-VATPC为靶标的新药筛选模型提供了重要的理论基础。
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