汉黄芩素(wogonin)是半枝莲的主要活性成分之一,为一种天然黄酮类化合物,分子式为C16H12O5,具有抗氧化、抗菌、抗炎、镇静和广泛的抗肿瘤活性等作用。然而,汉黄芩素抗肿瘤活性的研究多集中于体外观察其对肿瘤的细胞毒活性,体内应用汉黄芩素是否具有抗胃癌活性、以及汉黄芩素在杀伤胃癌细胞的同时,对机体树突状细胞(DC)和T/NK淋巴细胞功能的影响如何,期待深入研究。本文首先基于胃癌临床资料,观察人体胃癌组织VEGF表达、血清VEGF浓度分别与局部肿瘤DCs浸润及其活性的关联；其次基于小鼠荷瘤模型,明确汉黄芩素是否具有抑制胃癌生长,以及荷瘤小鼠经汉黄芩素治疗后体内细胞免疫功能的变化；并分析汉黄芩素对生理状态及胃癌微环境中树突状细胞(DC)活性的影响及其机制；最后观察汉黄芩素直接对T细胞和NK细胞功能的影响,以及是否协同DSS诱导小鼠肠炎的发病,从而深入阐明汉黄芩素体内抗肿瘤活性的机制。研究内容分为4部分：1.胃癌组织VEGF表达及血清VEGF浓度与DC浸润及其活性的关联分析目的：分析胃癌患者肿瘤组织VEGF表达、血清VEGF浓度对肿瘤组织内DCs浸润及其活性的关联,明确VEGF对DC表达CD86的影响。方法：应用免疫荧光法检测胃癌组织肿瘤细胞和CDllc+细胞VEGF的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清VEGF的浓度。分离胃癌患者和健康个体外周血单个核细胞(PBMC),利用GM-CSF和IL-4体外诱导为DC,比较两组人群DC表面HLA-DR和CD86的表达。最后用重组VEGF蛋白体外刺激DC,观察VEGF对DC表达CD86的影响。结果：胃癌组织VEGF阳性表达率明显高于癌旁组织,VEGF表达强度与DC浸润程度呈反向关联。VEGF的表达与胃癌的大小、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。CD11c+DC密度的浸润密度与淋巴结转移、TNM分期呈负相关。胃癌组织中CD11c+VEGF+双阳性细胞频率明显高于癌旁组织。CD11c+VEGF+细胞密度与TNM分期、淋巴结转移均正相关。胃癌患者血清内VEGF浓度明显高于健康个体。与健康个体相比,胃癌患者外周血单个核细胞来源DC表面HLA-DR和CD86的表达均降低。重组VEGF下调胃癌患者DC表面CD86的表达。结论：胃癌细胞VEGF的表达强度与肿瘤组织DC浸润密度呈负相关,而胃癌患者血清高浓度VEGF与其外周血单核细胞来源DC表面HLA-DR和CD86的表达降低有关,肿瘤组织分泌VEGF的DC频率与胃癌进展呈正相关。提示采取靶向抑制肿瘤细胞分泌VEGF和增强DC功能的治疗方法,可取得较好的抗肿瘤治疗效果。2.汉黄芩素抑制胃癌及免疫增强双向调节活性及初步机制目的：体外观察汉黄芩素对胃癌细胞凋亡、VEGF分泌、MHCI类相关抗原A(MICA)和B7H1表达的影响,分析汉黄芩素处理胃癌细胞后形成的凋亡小体是否易于被DC吞噬,基于小鼠移植瘤模型明确汉黄芩素体内抗胃癌生长的活性及对肿瘤微环境中淋巴细胞的影响。方法：首先在SGC-7901和MFC细胞的培养体系中,分别加入不同浓度汉黄芩素孵育12小时,流式细胞仪(FCM)检测胃癌细胞的凋亡情况。另外,用ELISA方法分别检测胃癌细胞上清液中VEGF、HMGB1的分泌,FCM检测肿瘤细胞CRT、MICA、B7H1的表达。其次分离胃癌患者外周血PMBC,诱导成未成熟DC,将汉黄芩素各组处理后的SGC-7901细胞与iDC共培养48小时,用流式细胞仪检测各组CD11c+CFSE+细胞的表达。取胃癌MFC细胞,以1×106/ml/接种于615小鼠腋下成癌。以不同剂量腹腔注射汉黄芩素,每天1次,连续3周,观察肿瘤组织生长及小鼠存活情况。最后,FCM检测小鼠移植癌组织及脾脏中CD4+T、CD8+T、NK细胞的频率；免疫荧光法检测小鼠移植瘤组织中VEGF、 RAE-1、B7H1的表达和CD4+、CD8+T、NK细胞的浸润情况。结果：汉黄芩素呈剂量依赖性诱导胃癌SGC-7901细胞和MFC细胞的凋亡,抑制胃癌SGC-7901和MFC细胞分泌VEGF,下调胃癌SGC-7901和MFC细胞表面B7H1和MICA (RAE-1)的表达。另外,汉黄芩素处理后的SGC-7901细胞形成的凋亡小体易被未成熟DC吞噬。汉黄芩素体内应用抑制胃癌移植瘤生长,在50mg/kg剂量组较为明显,且50mg/kg剂量组能显著延长615小鼠的生存期；汉黄芩素治疗组的荷瘤小鼠脾脏及肿瘤组织内CD4+T、CD8+T、NK细胞的频率增高,且汉黄芩素治疗组肿瘤组织表达VEGF,RAE-1、B7H1下降。结论：汉黄芩素不仅具有直接诱导胃癌细胞凋亡的活性,还可改善肿瘤局部免疫抑制性微环境。另外,汉黄芩素可通过诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡而促进DC的吞噬,继而激发肿瘤特异性免疫应答的产生。汉黄芩素有望成为一种兼具抗肿瘤和免疫增强双向调节活性的天然药物。3.汉黄芩素对树突状细胞活性的影响目的：体外观察汉黄芩素对DC表型和功能的影响,并基于小鼠移植瘤模型分析汉黄芩素抗肿瘤活性机制是否与DC有关。方法：流式细胞仪检测汉黄芩素对人、鼠DC表达HLA-DR, CD86、B7H1、MICA,分泌IL-1β、IL-12和IL-10的影响。观察汉黄芩素与LPS或VEGF联合刺激DC后,对DC表达CD86的影响。将汉黄芩素预先刺激小鼠骨髓来源DC,与脾脏CD4+T细胞按1：1比例共孵育48小时,用流式细胞仪检测CD4+CD69+, CD4+IFN-γ+, CD4+CD25+Foxp3+细胞的频率。最后,观察移植瘤小鼠脾脏单细胞悬液及荷瘤组织单细胞悬液中CD11c+、CD11c+CD86+、CD11c+B7H1+细胞的频率,免疫荧光法检测小鼠移植瘤组织中DC的浸润情况。结果：汉黄芩素呈剂量依赖性地降低健康个体和胃癌患者DC表面的HLA-DR、CD86、 B7H1、MICA分子的表达。汉黄芩素体外刺激降低小鼠脾脏DC细胞表面CD86和B7H1分子的表达；汉黄芩素体内刺激对小鼠脾脏DC细胞表面CD86和B7H1分子的表达无明显影响。汉黄芩素下调LPS刺激DC表面CD86的表达,协同VEGF诱导DC下调CD86的表达。汉黄芩素抑制DC分泌IL-1β、IL-12和IL-10。经汉黄芩素刺激的DC促进CD4+T细胞表达CD69以及分泌IFN-γ,同时剂量依赖性抑制Treg细胞的存活。汉黄芩素治疗荷瘤小鼠后,增加荷瘤小鼠脾脏及肿瘤组织中DC细胞的频率。结论：尽管汉黄芩素下调DC一些重要表面分子的表达及细胞因子的分泌,经汉黄芩素处理的DC却具有增强CD4+T细胞的功能、并促进移植瘤鼠脾脏及瘤体内DC的频率,提示汉黄芩素对DC活性的影响是发挥其抗肿瘤活性的机制之一4.汉黄芩素对T和NK细胞功能的影响目的：分析汉黄芩素对T和NK细胞功能的直接影响,并明确这种影响效应是否协同DSS诱导小鼠肠炎的发病。方法：体外和体内分别以汉黄芩素刺激,FCM分别检测脾脏CD4+T、CD8+T和NK细胞表面相关活化性受体的表达。受汉黄芩素刺激后,检测CD8+T、NK细胞杀伤靶细胞活性及CD8+T、CD4+T细胞和NK细胞分泌IFN-γ的情况。在给小鼠口服DSS的同时,腹腔注射不同剂量组(50、100mg/kg)汉黄芩素,称量体重变化,观察小鼠肠炎发病情况。并用组织免疫荧光法观察肠炎组织中CD4+、CD8+T细胞及NK细胞浸润的情况,用流式细胞仪分别检测肠炎组织单细胞悬液中CD4+T、CD8+T和NK细胞的频率及其表达相应活化性受体的情况。结果：汉黄芩素体外刺激小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞和NK细胞活化,且同时抑制调节性T细胞的生成。体内注射汉黄芩素对CD4+T和NK细胞活化均无明显影响,可轻度促进CD8+T细胞活化。汉黄芩素可提高CD8+T细胞杀伤MFC靶细胞的活性,增强NK细胞杀伤其靶细胞YAC-1的活性,且CD8+T、NK和CD4+T细胞分泌IFN-y的能力均被上调。汉黄芩素协同DSS诱导小鼠肠炎的发生,小鼠体重下降程度更剧烈,肠道坏死现象明显。免疫荧光法显示肠炎组织中CD4+、CD8+T细胞及NK细胞浸润频率明显增加。汉黄芩素联合DSS刺激组小鼠脾脏内CD4+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞、NK1.1+CD69+细胞的频率明显增高,且肠炎组织内淋巴细胞CD4+、CD8+T细胞及NK细胞的浸润频率增高,以效应性细胞为主。结论：汉黄芩素具有直接刺激T和NK细胞功能的活性,协同DSS诱导小鼠肠炎的发生,进一步证明汉黄芩素具有上调细胞免疫功能的活性。综上所述,本文深入探索了汉黄芩素对胃癌细胞凋亡及对肿瘤局部免疫抑制微环境的影响,在明确汉黄芩素体内具有抑制胃癌生长活性的基础上,揭示汉黄芩素的抗肿瘤活性与其诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、促进DC与CD4+T细胞对话、以及直接刺激T和NK细胞活化有关。我们的研究不仅初步阐明汉黄芩素抑制胃癌生长的细胞与分子机制,还为汉黄芩素联合应用胃癌常用化疗药的临床治疗提供重要的实验依据。