论文部分内容阅读
癌症严重威胁着人类的健康。目前,临床治疗癌症的主要手段包括外科手术切除、放疗和化疗等。化疗作为临床常用的治疗手段,大多存在着对肿瘤选择性差、药物利用率低、在杀死肿瘤的同时也会对正常组织和器官造成严重损伤等弊端。一些细胞内作用的抗癌类蛋白药物(如颗粒酶B(granzyme B,Gr B)、细胞色素C(cytochrome C,CC)和saporin(SAP))因其高效、高特异性和低毒副作用等优点而得到人们广泛的关注。然而,由于缺乏安全有效的递送系统,蛋白药物的临床转化受到极大地限制。为了解决这个关键科学问题,人们开发了多种纳米载药体系如脂质体、囊泡和纳米凝胶等,并将之应用于蛋白药物的肿瘤靶向治疗。论文第一章介绍了各种纳米载体用于蛋白质的包载和控制释放,以及卷曲螺旋结构在纳米载药体系中的应用。论文第二章,我们基于透明质酸对CD44的靶向性,以及CD44在MCF-7乳腺癌细胞表面过表达的特性,设计制备了p H敏感卷曲螺旋多肽交联透明质酸纳米凝胶(HA-c NGs),并包载毒素蛋白saporin(SAP,一种能够使核糖体失活的蛋白质)得到HA-c NGs-SAP,以实现SAP的MCF-7人乳腺癌细胞靶向递送。实验中,我们首先将多肽E3(GY(EIAALEK)3GC)和多肽K3(GY(KIAALKE)3GC)分别与HA反应得到偶联物HA-E3和HA-K3,然后通过纳米沉淀法得到粒径为176 nm的纳米凝胶HA-c NGs。圆二色谱(circular dichroism,CD)结果表明,HA-c NGs中的多肽E3和K3能够在p H 7.4形成稳定的卷曲螺旋结构,并在p H 5.0快速解螺旋,表现出典型的酸敏感响应性。HA-c NGs能够很好地包载模型蛋白药物CC,并在微酸条件下将之快速释放(在p H 7.4、p H 6.0和p H 5.0条件下蛋白24 h内的累积释放量分别为18.4%、76.8%和91.4%)。共聚焦显微镜和流式细胞实验结果均显示包载CC的HA-c NGs能够高效地被MCF-7细胞内吞。在细胞内涵体环境下,纳米凝胶迅速解卷曲螺旋结构,暴露出的E3和K3可与内涵体膜融合,进一步帮助CC逃离内涵体。在此基础上,我们将SAP装载到HA-c NGs中,顺利将SAP大量携带至CD44过表达的MCF-7细胞,产生强烈的体外抗癌效果,IC50值低至12.2 n M(以SAP计)。流式Annexin VFITC/PI双染色技术进一步证明,HA-c NGs-SAP可诱导大量MCF-7细胞进入凋亡程序。此外,初步的动物实验结果证明,载CC纳米凝胶(HA-c NGs-CC)可在荷瘤动物活体内实现较好的MCF-7皮下肿瘤靶向富集,展示了较好的应用前景。论文第三章在上述研究基础上,进一步考察HA-c NGs-SAP对CD44过表达MDAMB-231三阴乳腺癌细胞的体外抗肿瘤活性。细胞实验结果表明,HA-c NGs-SAP对MDA-MB-231细胞同样具有很强的生长抑制效果,IC50为14.3 n M(以SAP计,和对MCF-7的抑制水平接近)。此外,划痕实验结果表明HA-c NGs-SAP可有效抑制MDAMB-231细胞的迁移能力。初步的动物实验结果表明,HA-c NGs-CC同样在活体水平展现出较好的MDA-MB-231皮下肿瘤靶向富集水平。第四章对全文进行总结,并对下一步研究工作进行展望。