糖尿病（DM）是一种由多病因引起的以慢性高血糖为主要特征的代谢紊乱疾病,目前已成为世界范围内的主要公共卫生问题。DM多诱发血管性并发症,并危及许多器官如心、脑、肾、眼、足等,其中心血管疾病的并发症比较高。近年来,与糖尿病相关的冠脉微循环障碍逐渐引起研究者的注意。心脏微血管主要由位于循环末端的心脏微血管内皮细胞（CMEC）组成,控制心肌灌注和冠状动脉储备。鉴于微血管与血流之间的直接接触,CMEC比心肌细胞更容易受到高血糖损伤。随着糖尿病的发生和发展,CMEC能量代谢发生异常,导致维持血管稳态的内皮调节受损,最终导致微循环功能障碍,其机制可能与多元醇途径通量增加、己糖胺途径过度活化,导致过度的AGEs和ROS生成有关。目前,糖尿病的治疗多以降糖为主,但大多数抗糖治疗未能降低心血管风险。因此,在高糖状态下寻找减轻心脏微血管损伤的方法是延缓或减轻糖尿病心血管并发症的关键。双参宁心胶囊（SSNX）是由人参、丹参、延胡索三味中药的有效部位按一定比例配伍而成,是本科室自主研发的一种创新组分中药,具有益气活血、行气止痛的功效,其中人参益气补虚,丹参活血化瘀,延胡索活血行气止痛,三药配伍,标本兼治,用于治疗胸痹、冠心病气虚血瘀证。本科室以往研究发现,SSNX可降低心肌耗氧量、改善心肌细胞能量代谢,对急性心肌缺血和心肌梗死有改善作用;此外,SSNX还可扩张血管、增加心脏冠脉血流量,对阻塞性冠脉微循环障碍有明显的改善作用,但对糖尿病诱导的冠脉微循环障碍的影响及作用机制尚未研究。因此,本研究通过体内和体外实验来研究SSNX对糖尿病冠脉微循环功能障碍的影响及分子机制。目的采用体内和体外实验阐明SSNX改善糖尿病冠脉微循环功能障碍的作用及分子机制。研究内容与方法一、双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍的影响及机制研究1双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠糖脂代谢的影响采用高糖高脂饲料饲养自发糖尿病KKay小鼠建立糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠模型,饲养4周后,检测空腹血糖（FBG）和心肌灌注情况,以FBG≥11.1 mmo/L 且心肌灌注能力明显低于对照组的小鼠为模型复制成功（模型成功率为81.2%）。将成模小鼠随机分为模型组、双参宁心胶囊高剂量组（SSNX,360 mg/kg）、双参宁心胶囊中剂量组（SSNX,180 mg/kg）、双参宁心胶囊低剂量组（SSNX,90mg/kg）、通心络组（2g/kg）、尼可地尔组（10mg/kg）,每组13只,另13只健康C57BL/6J小鼠作为正常组。正常组小鼠给予常规饲料饲养,药物组按照0.1ml/10g灌胃给药,正常组、模型组给予同体积的蒸馏水,每天灌胃1次,连续8周。分别于给药前（0w）、给药2w、4w、6w、8w检测各组小鼠体质量、FBG,给药前（0w）、给药8w检测各组小鼠糖化血红蛋白（HbA1c）。实验结束后,用生化法检测各组小鼠血脂四项（TC、TG、LDL-C、HDL-C）,过碘酸雪夫染色法（PAS染色）检测各组小鼠心肌组织中糖类水平,免疫组化法检测各组小鼠心肌组织中脂肪酸转运蛋白（CD36）表达水平。2双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能的影响模型建立及分组给药同上。实验结束后,HE染色观察心肌组织形态,Masson染色检测心肌纤维化,超高分辨率小动物超声仪检测小鼠舒张功能、心肌血流灌情况,免疫组化法检测心肌组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）水平、心肌微血管密度（MVD）,透射电镜观察心肌微血管超微结构,ELISA法检测血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、脑钠肽（BNP）水平。3双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍的分子机制研究根据前面的综合结果,SSNX高剂量对改善糖尿病冠脉微循环的效果最好,本部分采用第一部分实验中保存的正常组、模型组、SSNX高剂量组小鼠的左心室组织（每组2个）,应用单细胞核转录组测序（snRNA-seq）技术分析SSNX潜在的分子作用机制。4双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠心脏PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路的影响模型建立同上。将成模小鼠随机分为模型组、双参宁心胶囊组（SSNX,360 mg/kg）、通心络组（2g/kg）、尼可地尔组（10mg/kg）,每组13只,另13只健康C57BL/6J小鼠作为正常组。药物组按照0.1ml/10g灌胃给药,正常组、模型组给予同体积的蒸馏水,每天灌胃1次,连续8周。实验结束后,蛋白免疫印迹法检测各组小鼠心肌组织中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、eNOS、HK1、PFK-1、PFKFB3蛋白水平,硝酸还原法检测血清一氧化氮（NO）含量,ELISA检测血清内皮素1（ET-1）、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）含量。二、双参宁心胶囊及其有效成分Rg1、SAA、DHC对高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤的影响及分子机制研究1双参宁心胶囊及其有效成分Rg1、SAA、DHC对高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤的最佳保护浓度和保护作用成分的筛选采用小鼠心肌微血管内皮细胞（MMVEC）,建立高糖诱导MMVEC损伤模型,CCK8筛选SSNX、Rg1、SAA、DHC对高糖诱导MMVEC损伤的最佳有效浓度;硝酸还原法检测细胞NO含量、ELISA法检测细胞ATP含量,观察SSNX、Rg1、SAA、DHC对高糖诱导MMVEC损伤的保护作用,筛选出保护作用成分。2 SAA对高糖损伤的心肌微血管内皮细胞PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路的影响采用上面建立的高糖诱导MMVEC损伤模型,实验分为正常组（Con,葡萄糖浓度为5.5 mmol/L）,模型组（HG,葡萄糖浓度为250 mmol/L）,SAA低剂量组（HG+SAA 25μM）,SAA 高剂量组（HG+SAA 50μM）,SAA+抑制剂组（HG+SAA 50μM+LY）,抑制剂组（LY,葡萄糖浓度为 5.5 mmol/L）,CCK8检测各组细胞存活率,Seahorse XFp生物能量分析仪检测各组细胞糖酵解水平,ELISA检测各组细胞ATP含量,硝酸还原法检测各组细胞NO含量,蛋白免疫印迹法检测各组细胞 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、eNOS、HK1、PFK-1、PFKFB3 蛋白水平,RT-qPCR 检测各组细胞PI3K mRNA、AKT mRNA、AMPK mRNA、eNOS mRNA、HK1 mRNA、PFK-1 mRNA、PFKFB3 mRNA水平。结果一、双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍的影响及机制研究1双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠糖脂代谢的影响SSNX可降低糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠血清中TC、LDL-C的含量,降低心肌组织中糖类水平和CD36水平,对糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠的糖脂代谢有一定的改善作用。2双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能的影响SSNX可有效改善糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠的心肌组织形态,减轻心肌纤维化,改善心肌微血管的超微结构,增加心肌微血管密度,恢复心脏舒张功能和冠脉微循环功能,以上结果显示SSNX高剂量较中、低剂量效果更好。3双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍的分子机制研究各心脏样本定量质控后共得到41723个高质量细胞,降维聚类后得到16个最优细胞群,将其鉴定分为7种类型细胞:成纤维细胞（Fibroblasts:cluster 1）,心肌细胞（Cardiomyocytes:cluster 2、3、10、11、15）,内皮/成纤维细胞（endothelial/fibroblasts cells:cluster 5）,巨噬细胞（Macrophage:cluster 6、7、16）,内皮细胞（Endothelial cells:cluster 4、8、13）,周细胞（Pericytes:cluster 9、12）,平滑肌细胞（Smooth muscle cells:cluster 14）。SSNX可改善模型组小鼠心脏内皮细胞向成纤维细胞转化,降低成纤维细胞占比,改善心肌纤维化。内皮细胞鉴定为5个EC亚群:毛细血管内皮细胞（capillary EC）,大静脉内皮细胞（large vein EC）,动脉毛细血管内皮细胞（cap.arterial EC）,淋巴管内皮细胞（lymphatic EC）,动脉内皮细胞（artery EC）。这5个内皮细胞亚群分别有自己特异性表达的基因和功能,但是也共享其他基因表达,在功能上相互联系。值得注意的是,capillary EC特异性表达基因主要与内皮细胞增殖、存活、迁移作用相关,且capillary EC富集到通路主要与物质代谢相关,因此我们推测capillary EC中物质代谢与功能的变化在糖尿病冠脉微循环功能中起着重要作用。capillary EC中正常组、模型组、SSNX高剂量组的差异通路富集评分结果显示,SSNX可上调模型组小鼠心脏capillary EC中补体和凝血级联、糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、柠檬酸循环、氧化磷酸化、AMPK信号通路、脂肪酸代谢、肌动蛋白骨架调节、细胞粘附分子、缝隙连接、紧密连接等通路,下调精氨酸生物合成、大分子聚糖生物合成、坏死性凋亡、铁死亡、P53信号通路、TGF-β信号通路、AGE-RAGE信号通路、白细胞跨内皮迁移等通路。SSNX主要作用靶细胞为capillary EC,主要作用的途径与能量代谢、细胞死亡、炎性反应相关。capillary EC组间能量代谢相关基因分析发现,SSNX起调节作用的靶基因主要是糖酵解相关基因,包括 Hk1、Pfkm/PFK1、Pfkfb3、Gapdh、Ldhb、Pkm,SSNX可上调模型组中这些基因的表达,促进capillary EC能量代谢,维持正常的EC功能。综上,SSNX起调节作用的靶细胞为capillary EC,靶基因为糖酵解相关基因:Hk1、Pfkm/PFK1、Pfkfb3、Gapdh、Ldhb、Pkm。AMPK pathway 是 SSNX 作用的靶途径之一,AMPK可调控糖酵解途径中的限速酶参与能量代谢,也可调控eNOS维持内皮功能,而它本身受PI3K/AKT通路调控。因此,我们推测SSNX可通过靶向调节capillary EC的能量代谢,改善EC功能,进而改善糖尿病冠脉微循环功能,而这可能与PI3K/AKT/AMPK/eNOS相关。4双参宁心胶囊对糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠心脏PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路的影响SSNX能通过调节PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路,一方面改善EC能量代谢,促进糖酵解关键限速酶HK1、PFK1及糖酵解途径调节因子PFKFB3表达,增加血清ATP含量;另一方面又能改善EC功能,促进其分泌NO,进而改善糖尿病冠脉微循环功能。二、双参宁心胶囊及其有效成分Rg1、SAA、DHC对高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤的影响及分子机制研究1双参宁心胶囊及其有效成分Rg1、SAA、DHC对高糖诱导心肌微血管内皮细胞损伤的最佳保护浓度和保护作用成分的筛选葡萄糖浓度为33 mmol/L时开始对MMVEC细胞有损害作用,随着葡萄糖浓度增加,其对MMVEC细胞的损害程度也增强,本实验最终选用葡萄糖浓度为250 mmol/L作用下的MMVEC细胞为高糖诱导的细胞损伤模型;SSNX 20、40、80 μg/ml可有效改善高糖诱导MMVEC细胞存活率,且80 μg/L效果最好;Rg1 25、50、100、200、400 μmol/L可有效改善高糖诱导MMVEC细胞存活率,且200 μmol/L的效果最好;SAA6.25、12.5、25、50μmol/L可有效改善高糖诱导MMVEC细胞存活率,且50μmol/L的效果最好;DHC 16 μmol/L可有效改善高糖诱导MMVEC细胞存活率;SAA可有效改善高糖诱导MMVEC细胞中NO、ATP的含量。2 SAA对高糖损伤的心肌微血管内皮细胞PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路的影响SAA能通过调节PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路,一方面改善MMVEC糖酵解水平,促进糖酵解关键限速酶HK1、PFK1及糖酵解途径调节因子PFKFB3蛋白表达及其mRNA表达,增加细胞ATP含量;另一方面又能改善MMVEC功能,促进NO分泌。结论1双参宁心胶囊可通过增加心肌微血管密度,改善心肌微血管超微结构,增强糖尿病冠脉微循环功能障碍小鼠的冠脉微循环功能。2双参宁心胶囊影响心肌微血管内皮细胞的靶细胞主要为capillary EC,作用靶基因为糖酵解相关基因:Hk1、Pfk1、Pfkfb3,靶途径为AMPK通路。3双参宁心胶囊可通过调节PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路,一方面改善心肌微血管内皮细胞能量代谢,另一方面改善心肌微血管内皮细胞功能,进而改善糖尿病冠脉微循环功能。总之,双参宁心胶囊及其有效成分SAA可通过调节PI3K/AKT/AMPK/eNOS通路,靶向心肌capillary EC糖酵解和功能,改善糖尿病冠脉微循环功能障碍。