自然环境中的微生物大都以群落形式存在,它们通过驱动生命基本元素进行生物地球化学循环,分解各种污染物。沉积物是一个特殊的水生环境领域,其中的微生物多样性比其对应的水体环境更加丰富。为了更好的理解微生物对生物地球化学循环的潜在影响,寻找微生物资源,科学家们对沉积物特别是海洋沉积物展开了广泛的研究。另外,研究者在潮间带根际和沉积物中发现了大量与初级生产力有关的微生物,并且发现了大量外源污染物降解菌,也引起了研究者在潮间带沉积物中寻找微生物资源的兴趣。而相对上述两种类型的沉积物人们对淡水沉积物的研究较少。据报道,Meta分析显示淡水沉积物的细菌和古细菌α多样性比海洋沉积物要丰富。但是许多研究实验因素如PCR条件,测序方法,16srRNA可变区和引物的选择会影响微生物的α多样性分析。本研究采用统一的实验方案,通过Illumina高通量测序技术,详细比较了中国南部沿珠江分布的淡水,潮间带和海洋三种沉积物中的微生物群落结构,分析比较不同类型沉积物中的微生物α和β多样性的异同。目的比较中国南部沿珠江分布的淡水、潮间带和海洋三种不同类型沉积物微生物多样性及每种沉积物中主要富集的微生物物种；通过分析潮间带湿地沉积物细菌和古细菌群落结构特点,为潮间带是一个独特的海陆边缘生态系统理论提供一些理论依据。材料和方法我们于2009年8月在流溪河水库(LXR freshwater)、潮间带湿地(香港米埔红树林湿地-MP)和近海港口(YOW)共采集35个土壤样品。其中淡水沉积物13个样品,潮间带湿地沉积物14个,海洋沉积物8个；所有的沉积物样品用Mobio土壤DNA提取试剂盒提取沉积物中基因组总DNA；用带有barcode的16s rRNA V6细菌引物967F(CNACGCGAAGAACCTTANC)和1046R(CGACAGCCATGCANCACCT)扩增35个沉积物样品,另外,用同样带有barcode的16srRNAV6古细菌引物958F(AATTGGANTCAACGCCGG)和1048AR(CGRCGGCCATGCACCWC)扩增13个潮间带沉积物样品。扩增后的PCR产物混合后送去华大基因公司用Solexa GAII测序仪进行PE75测序；测序数据我们采用BIPES分析流程提取粗序列,用UCHIME去除嵌合体,最终得到的干净序列再用TSC聚类算法聚成相似度为97%OTUs,最后用包含这些OTUs分类信息的群落结构分析沉积物的微生物多样性。结果1三种沉积物测序数据经过BIPES流程分析共得到2,318,609条序列,UCHIME去除嵌合体后剩余2,311,761条序列,然后经TSC聚成96,937个OTUs。样品的测序深度大都在(4万-10万)条序列,其中一个样品W12达到174,678条序列。通过做三种沉积物归一化和非归一化的稀释曲线分析比较沉积物群落结构的α多样性,结果显示上游淡水湖沉积物的细菌群落α多样性最高,海洋沉积物最低,潮间带沉积物细菌群落α多样性处于中间位置。三种沉积物群落结构门水平的分布模式显示,潮间带沉积物主要细菌门的群落分布模型同样介于淡水湖和海洋沉积物之间,和前面的细菌群落α多样性分析结果类似。门水平级别所有样品的OTUs做主成分分析,PCA结果显示三种微生物群落在门水平级别可以非常明显的分开,说明三种沉积物中的细菌门有较大的差别。例如,变形杆菌组(Y-、ε-、δ-和NA)主要富集在海洋和潮间带沉积物中；而酸杆菌和硝化螺菌主要富集在淡水沉积物中。三种类型沉积物群落结构属水平分析。文中列出10种多度最高种属,发现潮间带沉积物可能是淡水与海洋沉积物的一个过渡。PCA主成分分析属水平与门水平结果相比,三种沉积物群落分开的更好,说明三种沉积物细菌属的差异更加明显。另外,潮间带沉积物中富集大量与硫还原有关的种属脱硫洋葱菌属(Desulfobulbus),硫还原菌属(Desulfobacterium),脱硫单胞菌(Desulfuromonas), Desulforhopalus和脱硫杆菌属(Desulfofustis)。此外,我们还发现潮间带湿地中细菌群落与五种已知环境因子中的三种营养相关环境因子(TOM,TKN和TP)紧密相关。三种类型沉积物群落结构属水平分析OTUs水平分析。用全部OTUs数据聚类分析,primer6.0聚类结果显示三种沉积物共聚成两类：淡水沉积物聚成一类,海洋沉积物与潮间带沉积物聚成一类。PCA主成分分析同样展现类似的结果。在OTUs不同多度水平(≥0.1%到只包含两条序列)上做PCA主成分分析,,结果显示在OTUs不同多度水平上三种沉积物的细菌群落结构都可以明显的区分开,说明不论是高多度还是稀有的细菌群落都会特异的富集在各自的栖息地。另外,随着OTUs多度水平的增加,主成分分析PC1+PC2的所占比例也逐步增大,说明高多度的物种相对低多度物种受到的环境压力选择更大。LEfSe统计结果显示,淡水沉积物主要富集酸杆菌,硝化螺菌属,疣微菌门和α-和β-变形杆菌。潮间带沉积物生物富集一些初级生产者和腐生菌,如Chloroflexi(绿湾菌门),Bacillariophyta (硅藻门),γ-、ε-Proteobacteria (γ-ε-变形杆菌),Bacteroidetes (拟杆菌门),Firmicutes (厚壁菌门),和Actinomycetales (放线菌门)。而海洋沉积物则主要富集γ-和δ-变形杆菌中的一些厌氧条件下与硫还原有关的细菌目。2潮间带13个沉积物样品(除去W12)经过BIPES分析共获得了839,616条16S rRNAV6序列。去除嵌合体后,共获得837,041条干净的序列,每个样品大概平均64,388条序列(从47,583条到80,427条)。所有样品归一化成40000条序列。α多样性分析结果显示有植被覆盖的沉积物微生物多样性要比无植被覆盖的光滩高。微生物群落相似性分析结果显示所有样品共聚成两类。第一大类包括泥滩沉积物,米草沉积物和红树林边缘沉积物三种采样点样品。第二类包括红树林内部和根际沉积物,这两类沉积物进一步聚成五个亚组。并且在OTUs不同多度水平(≥1000,100-999,10-99,2-9)上的聚类模式与用全部OTUs得到的结果类似。潮间带沉积物细菌门水平分析,显示平均多度水平≥l%的门或变形菌纲共有16个。γ-、δ-变形杆菌和浮霉菌门这三种门在五种采样点的沉积物中所占比例都达到50%。比较第一组和第二组微生物群落,16种多度较高的门中有6种具有统计学意义(t-test,P<0.05),这些门是Planctomycetes(浮霉菌属),Firmicutes(厚壁菌门),Chlorobi(绿菌门),s-Proteobacteria(ε-变形杆菌),Nitrospira(硝化螺菌属),Lentisphaerae(黏胶球形菌门)。潮间带沉积物中高多度OTUs。潮间带湿地沉积物10种多度最高的OTUs9种是来自变形杆菌,特别是γ-和6-变形杆菌。统计分析显示五种沉积物中10种多度最高的OTUs有8种是具有统计学意义的(one-way ANOVA test, P<0.05)。五种不同栖息地中OTUs的统计学差异。将OTUs分成4种不同多度水平,将13个沉积物样品中OTUs多度数据每行都采用均数和标准差公式(Value=[(Value)-Mean(Row x)]/[Standard deviation(Row x)])进行归一化后用one-way ANOVA test统计分析方法做差异OTUs热图揭示了五种不同沉积物中OTUs存在统计学差异(P<0.05)。在每种多度水平上,我们都能看到OTUs在五种不同沉积物中的相对多度差异,说明细菌群落之间的差异可能是由于栖息地环境选择的结果。对两大聚类组的OTUs采用t-test进行统计分析,两大聚类组中有统计学差异的OTUs存在于同一细菌门的现象揭示了不同的栖息地有不同的选择优势。另外,还揭示了泥滩和根际沉积物特殊的OTUs。泥滩中大部分的菌群主要是硫酸盐还原菌,脱硫单胞菌,酸杆菌门,梭菌目,和外硫红螺菌科；而根际中特殊的OTUs主要来自浮霉状菌科,生丝微菌属,假单胞细菌目,硝化螺菌属和暖绳菌科。3潮间带12个沉积物样品经过BIPES分析共获得129,830条序列。去除嵌合体后共获得129,480条干净的序列,每个样品大概平均10,790条序列(从2,088条到30,084条)。所有的干净序列经TSC聚类后得到3404个OTUs。通过做潮间带湿地沉积物归一化和非归一化的稀释曲线分析比较湿地内部不同采样地点的古菌α多样性,结果显示红树林边缘沉积物古细菌多样性最高,泥滩次之,根际再次之,而红树林内部的古细菌多样性最低。这与我们前面分析的潮间带湿地的细菌α多样性相反。潮间带湿地古细菌群落门分布模式显示四个采样点古细菌群落分布大致一致,主要由广古菌门和泉古菌门组成,另外,在mangrove组和nudflat组还有很少一部分纳米古菌门存在。潮间带湿地古细菌群落纲分布模式显示泉古菌门共有4个分类群,主要是热变形菌纲,其次MBGB,而MGⅠ和MBGA这两个类群相对较少。广古菌门有8个分类群,以甲烷微菌纲为主,后面的几种分类群依次是甲烷杆菌、热原体纲、嗜盐杆菌、TMEG、甲烷球菌纲、热球菌纲和MGⅡ。潮间带湿地全部的OTUs PCA主成分分析显示除了nudflat组样品聚类紧密外,其余三组样品聚类较分散,这可能是由于我们的测序深度不够或是样品之间差异不大所造成的。结论1细菌多样性以淡水沉积物最高,潮间带次之,海洋最低。2潮间带内部有植被覆盖的沉积物细菌α多样性高于无植被覆盖的光滩沉积物。3古细菌与细菌相反,其α多样性光滩沉积物高于红树林沉积物。4淡水沉积物中主要富集酸杆菌,硝化螺菌属,α-和β-变形杆菌和疣微菌门；海洋沉积物富集一些γ-和δ-变形杆菌中在厌氧条件下与硫还原有关的细菌目；而潮间带沉积物则主要富集一些初级生产者和腐生菌,如绿湾菌门,硅藻门,γ-和ε-变形杆菌,拟杆菌门,厚壁菌门和放线菌门。另外,古细菌群落主要由泉古菌门(热变形菌纲)和广古菌门(甲烷微菌纲)组成。