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包虫病是由中绦期细粒棘球绦虫引起的,该病在全球范围内均有分布,我国是该病高发的国家和地区之一。该病危害性大,患者10年病死率高达94%。防控措施以吡喹酮犬犬投药月月驱虫为主,尽管有效,但是在基层难以长期坚持,而且流浪狗难以管理;针对中间宿主的EG95疫苗对移行期内的病原防控有效,但是终末宿主与中间宿主数量比达到45:1,防控成本很高;因此,建立针对终末宿主有效的免疫预防方法是防控该病的一致研究方向。国内外研究表明,四跨膜蛋白家族(TSP)在寄生虫的研究中具有很好的免疫原价值,因此,本试验针对Eg-TSP14和Eg-TSP33进行了克隆、原核表达以及免疫原性初步研究,以期为Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作为疫苗候选抗原的潜力提供理论基础。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并构建重组pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33质粒,转化至大肠杆菌中进行原核表达,并将重组蛋白免疫小鼠对其免疫原性进行初步研究。方法:(1)以细粒棘球绦虫成虫、原头蚴和包囊壁的cDNA为模板,利用荧光定量PCR技术进行扩增,分析两个基因在虫体不同发育阶段的差异表达情况。(2)克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,构建表达重组载体pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33。构建成功的载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中,加入IPTG进行诱导表达,将表达后的蛋白用Ni柱进行纯化并定量。(3)纯化后的蛋白进行Western Blot,验证其反应原性。(4)将重组蛋白免疫小鼠,收集小鼠脾脏和血清,荧光定量PCR测定细胞因子变化和间接ELISA法测定抗体变化。结果:(1)荧光定量PCR结果显示,Eg-TSP14在包囊壁以及原头蚴中有表达,在包囊壁中的表达量高于原头蚴中的表达量。Eg-TSP33基因在成虫、包囊壁、原头蚴中均有表达,在包囊壁中TSP33基因表达量高于原头蚴阶段和成虫阶段。(2)克隆后的Eg-TSP14大小为270bp,Eg-TSP33为420bp,构建好的重组载体经过双酶切鉴定后,进行IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE,重组蛋白rEg-TSP14大小27kDa,重组蛋白rEg-TSP33大小为32kDa,与预期结果大小一致,表达形式分析结果显示两者均在沉淀中以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白rEg-TSP14浓度为1.4mg/mL,重组蛋白rEg-TSP33浓度为1.7mg/mL。(3)Western blot结果显示,重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可与犬阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。(4)重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可以引起小鼠血清抗体水平升高。(5)细胞因子检测结果显示rEg-TSP14可以引起Th2型细胞因子的变化,与对照组相比差异显著(P<0.05),rEg-TSP33可引起Th1型细胞因子变化。结论:Eg-TSP14和Eg-TSP33分别能在虫体不同发育阶段表达,可能在虫体发育过程中起重要作用,对其免疫原性研究发现,两个蛋白均能诱导小鼠产生免疫反应。细胞因子监测点结果推测Eg-TSP33可能会增强宿主抗感染能力,有利于在感染早期将病原体清除,而Eg-TSP14则可能在E.g.免疫逃避中发挥作用,有利于E.g.在宿主体内建立感染。