角膜缘微环境细胞(LNC)与骨髓间充质干细胞(BMMSC)基因表达差异分析

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目的:比较人角膜缘微环境细胞(limbal niche cells,LNC)与骨髓来源间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSC)的基因表达差异。  方法:采用胶原酶A消化法、改良的胚胎干细胞培养基(MESCM)分离人角膜缘组织得到的单个细胞,于5%Matrigel包被的塑料培养板上连续传代扩增得到人角膜缘微环境细胞(LNC),对照组采用人骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC),第4-6代细胞进行实验。使用ImageJ软件测量LNC及BMMSC细胞直径。采用Affymetrix Human PrimerView Gene Expression Array表达谱基因芯片比较LNC与BMMSC基因表达的相对水平,每组4个样本。RT-PCR对CD73、CD90、CD105、PDGFRβ和Vimentin进行检测并对差异显著的基因进行验证。  结果:LNC最小直径为4.30μm,最大直径为20.5μm,95%的细胞直径在5.58~14.9μm,平均直径为10.2±2.36μm。BMMSC最大直径为27.9μm,最小直径为5.74μm,95%的细胞直径在7.35~20.6,平均直径为14.0±3.38μm。基因芯片共检测了20432个基因,其中表达差异大于2倍的有2661个,LNC表达比BMMSC高的有1468个,比BMMSC低的有1193个。表达差异大于10倍有349个,其中LNC表达比BMMSC高的有226个,比BMMSC低的有123个。表达差异大于100倍的基因有13个,LNC比BMMSC高的有10个;而BMMSC比LNC高的基因有3个。LNC比BMMSC表达高出倍数最多(309倍)的基因是结肠腺瘤性息肉病下调1基因(Adenomatosis Polyposis Coli Down-Regulated1,APCDD1);而BMMSC比LNC高出倍数最多(256倍)的基因是透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1基因(Hyaluronan And Proteoglycan Link Protein1,HAPLN1)。GO分析发现差异基因主要参与或组成细胞外区域组分、单个或多细胞生物过程、细胞外空间;而KEGG通路分析结果表明差异基因主要富集于细胞外基质受体相互作用通路、阿米巴通路和局部粘附。此外,LNC中WNT蛋白家族表达较高,WNT2比BMMSC高6.1倍同时FZD1比BMMSC高3.4倍;而SCF较BMMSC高1.9倍,且编码其配体的基因KIT表达比BMMSC高4.2倍。RT-PCR检测发现LNC中CD73、CD90、CD105、PDGFRβ和Vimentin表达均比BMMSC高2倍以上。此外LNC中SCF表达比BMMSC高5.6倍。KIT(CD117)、COL14A1、LAMA2、THBS2、FZD1、BMP2、CXCL12、FGF13高2倍以上,与芯片结果一致。  结论:LNC与BMMSC表达有差异的基因主要与细胞外基质发育、细胞外基质相互作用、WNT通路等有关,这可能是其生物学特性存在差异的基础。
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