黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)和微囊藻毒素(Microcystin,MC)普遍存在于湿热的气候条件区域,人们主要通过被污染的食物和饮水造成AFT和MC的暴露。在一些发展中国家(包括中国),AFT和MC的污染现象十分普遍,并且两个毒素在这些区域往往同时存在。目前大量的实验室研究已经表明AFT和MC均会对机体造成明显的肝、肾损伤。然而AFT和MC暴露后对肝、肾的损伤作用比较及两者联合暴露对肝、肾的损伤作用效应还缺乏相关的流行病学研究和机制研究。AFB1和MC-LR分别是AFT和MC中最主要的毒性亚型(污染最重、毒性最大、研究最多)。氧化应激是两个毒素共有的重要毒性机制,两个毒素暴露后会导致机体产生大量的活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)从而导致细胞的氧化损伤,而ROS可以通过对细胞DNA产生氧化损伤作用造成细胞的遗传损伤。我们前期研究已经发现三峡库区存在一定程度的AFT和MC污染。因此,本课题第一部分在三峡库区AFT和MC暴露区域建立研究人群,获取他们的基本生活习惯、饮食饮水习惯、疾病家族史和健康资料等信息。第二部分利用人群的基线资料和健康体检结果,初步探讨两个毒素单独或联合暴露对无HBV感染和有HBV感染人群的肝损伤作用。第三部分同样利用人群的基线资料和健康体检结果,初步探讨两个毒素单独或联合暴露在人群中的肾损伤作用。第四部分在细胞层面,探讨两种生物毒素单独或联合暴露对L02细胞活性氧的影响及由此产生的DNA氧化损伤作用。第一部分、三峡库区黄曲霉毒素和微囊藻毒素暴露人群研究现场的建立一、方法:1、研究区域的选择李渡镇和义和镇位于三峡库区农村地区,地理坐标分别为28°28′N-31°44′N和105°49′E-110°12′E。两个镇的居民具有相同的生活习惯,而由于地理位置和经济条件的差别,两个镇生活的居民具有不同的饮水和食物来源,提示两个镇居民AFT和MC的暴露程度可能不同。2、研究人群的建立采用整群抽样的方法,对重庆涪陵区两个乡镇(李渡镇、义和镇)6467名志愿者进行问卷调查,采集人群的基本情况特征、生活习惯、药物使用情况、饮食饮水习惯、家族疾病史等资料。3、两个镇外环境中AFB1和MC-LR的检测我们用ELISA方法检测了两个镇居民日常饮食(大米、玉米、花生油、酱油、花生、辣椒、鸡蛋、菜籽油、豆瓣酱、鸡肉、猪肉、牛肉和鱼肉)中AFB1的含量;同时用ELISA方法检测了两个镇日常水源(三种饮水:井水、自来水、桶装水;四种生活基础水源:沟水、水源水、田水、池塘水)和食用水产品(鱼和鸭)中MC-LR的含量。4、病毒性肝炎的检测采用自动生化仪运用化学发光法检测了志愿者血液中的乙型肝炎病毒抗原(HBs Ag)和丙型肝炎病毒抗原(HBc Ag);并对乙型肝炎病毒抗原阳性者检测了血清中HBV DNA水平。5、血清肝、肾功能指标的检测2013年6月抽取每名志愿者5ml的静脉血,分离血清,并运用全自动生化分析仪采用酶联免疫法检测血清中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltransferase,GGT)、甘油三酯(Triglyceride,Tg)、总胆固醇(Total cholesterol,Tch)、血肌酐(Creatinine,Cr)、血尿素氮(Usea nitrogen,UN)和血糖(Glucose,Glu)的水平。6、统计分析采用Office 2007、SPSS 20.0软件进行数据统计分析,根据数据分布的特点,分别采用一般频数描述、卡方检验(χ2检验)对两个镇的毒素污染水平及肝肾功能酶水平进行比较。二、结果:1、研究区域AFB1和MC-LR污染情况MC-LR的检出率为68.70%(90/131),浓度从0.02-1.74μg/kg。在所有检测样本中,义和镇井水、末梢水以及水体的均值MC-LR浓度均显著性高于李渡镇;义和镇鸭肉及水产品均值MC-LR浓度均显著高于李渡镇。AFB1的检出率为42.24%(145/344),浓度从0.04-4.87μg/kg。在所有检测样本中,大米、玉米、花生、豆瓣酱、辣椒检出AFB1的浓度较高。十三种样品和总均值在两个镇之间没有显著性差异。2、研究人群流行病学特征共完成6467人的流行病学调查表填写或临床标本检测,其中同时完成调查表和肝、肾损伤检测的人数为5493人(李渡镇:义和镇=1857:3636)。两个镇年龄、性别、教育程度、收入、吸烟、被动吸烟以及药物使用方面具有显著性差异;两个镇在BMI、民族、出生地、饮酒方面没有显著性差异。3、研究人群健康特征研究人群中肝功能指标ALP、AST、ALT和GGT异常率百分比分别为3.44、10.16、4.81和9.92;肾功能指标肌酐、尿素氮和e GFR的异常率百分比分别为4.50、6.97和2.35;代谢相关指标Tch、Tg和Glu的异常率百分比分别为16.12、24.84和9.40。三、结论:本研究发现涪陵地区生活的居民存在AFB1和MC-LR的暴露;两个镇具有不同的AFB1和MC-LR暴露水平以及肝肾功能水平,提示AFB1和MC-LR可能是两个镇肝肾功能水平差异的重要原因。第二部分、三峡库区人群HBV、AFB1和MC-LR暴露与成人肝损伤关联性的横断面分析一、方法:1、人群暴露情况的计算根据每个居民的食物频数表资料和食物中AFB1和MC-LR的含量计算每个居民的日估计摄入量(Estimated daily Intakes,EDI)。2、两个镇人群肝功能酶、HBV感染、AFB1和MC-LR暴露情况比较3、所有研究人群中,三种危险因素单独暴露与肝功能酶指标关系的比较及联合毒性效应分析4、统计分析方法采用一般频数描述、卡方检验(χ2检验)、Kruskal-Wallis检验和多因素Logistic多因素分析等方法进行统计分析。二、结果:1、HBV DNA、EDIAFB1、EDIMC-LR以及肝功能酶的相关性AST及ALT均与HBV DNA水平、EDIAFB1以及EDIMC-LR显著性相关(P<0.05),并且与AST和ALT的相关系数均显示为HBV>EDIMC-LR>EDIAFB1。ALP和GGT只与EDIMC-LR显著性相关(P<0.05),与HBV DNA水平、EDIAFB1均不具有相关性(P>0.05)。2、HBV、AFB1和MC-LR单独暴露与肝功能的效应比较HBs Ag(+)人群AST和ALT的均值均显著高于HBs Ag(-),并且HBV DNA(≥100IU/m L)的人群AST和ALT的均值升高的更为明显。另外,与HBs Ag(-)人群相比,HBs Ag(+)人群和HBV DNA(≥100 IU/L)人群AST和ALT的OR值均显著升高,HBV(+)人群和HBV DNA(≥100 IU/L)的人群AST的OR值分别为2.413(95%CI=1.701-3.424)和5.322(95%CI=3.535-8.014);ALT的OR值分别为2.974(95%CI=2.009-4.403)和5.322(95%CI=3.535-8.014)。具有高分位数EDIAFB1和EDIMC-LR的人群,相比低分位数EDIAFB1和EDIMC-LR的人群,AST和ALT的均值均显著升高;但是相应的OR值并没有显著性变化。3、三个危险因素相互之间的协同作用比较在HBV(-)人群中,相比较AFB1和MC-LR都低暴露的人群,AFB1和MC-LR都高暴露的人群的AST和ALT的均值都显著升高,但是AST和ALT的OR值均没有显著升高。相比较HBV(-)人群,在不同的AFB1或MC-LR的暴露人群当中,HBV均能显著增加人群AST和ALT的均值以及OR值,尤其是在HBV DNA≥100m L的人群中,升高的情况更为明显。两个毒素低暴露的人群,矫正后的AST和ALT的OR值分别为4.647(2.253-9.585)和5.504(2.457-12.328);两个毒素高暴露的时候,矫正后的AST和ALT的OR值分别为16.402(4.862-55.340)和18.052(4.968-65.597)。三、结论:在三个肝损伤危险因素(HBV,AFB1和MC-LR)中,HBV是最主要的肝损伤危险因素,并且HBV能够增加AFB1和MC-LR肝损伤的危险性,控制HBV感染可能是预防人群环境毒素损害的重要手段。第三部分、三峡库区人群AFB1和MC-LR暴露与成人肾损伤关联性的横断面分析一、方法:1、人群肾功能指标异常情况与毒素的暴露量的关系分析2、人群AFB1和MC-LR毒素单独暴露与肾功能指标关系的比较及联合毒性效应分析3、统计分析采用一般频数描述、卡方检验(χ2检验)、Kruskal-Wallis检验和多因素Logistic多因素分析等方法进行统计分析。二、结果:1、毒素单独暴露与肾功能的关系比较具有较高MC-LR暴露的人群,其血清中Cr、BUN均值升高、e GFR均值降低,且三个指标异常率的OR值分别为Scr(OR=4.58,95%CI=2.92~7.21),BUN(OR=1.80,95%CI=1.34~2.42)和e GFR(OR=4.41,95%CI=2.55~7.63);而对于不同AFB1暴露水平的人群中,并没有发现Cr和BUN,e GFR具有显著性差异。2、两个毒素联合暴露与肾功能的关系联合暴露组的人群,一旦MC-LR处于高暴露,无论AFB1暴露高低情况如何,三个肾功能指标的OR值均显著升高,所有结果表明MC-LR可能是造成人群肾功能损伤的主要因素。相比较联合低暴露组,两个毒素高暴露组人群异常的Cr、BUN和e GFR的OR值分别为1.46(95%CI=1.10-1.94)、2.92(95%CI=1.96-4.36)和2.92(95%CI=1.66-5.16)。三、结论:MCs是重要的肾损伤危险因素,AFB1对肾损伤的作用并不显著,人群联合暴露于两个毒素后损伤效应均表现为MCs的肾损伤作用,控制MCs的暴露对人群慢性肾疾病的预防具有重要作用。第四部分、黄曲霉毒素和微囊藻毒素联合暴露致L02细胞DNA氧化损伤及氧化应激改变的研究一、方法:1、AFB1和MC-LR暴露与DNA氧化损伤的关系运用微核实验和彗星实验,确定AFB1和MC-LR对L02细胞的DNA氧化损伤效应。2、AFB1和MC-LR暴露与氧化应激的关系研究采用荧光探针(DCF-DA)检测AFB1和MC-LR染毒的L02细胞ROS的变化情况,确定两个毒素对细胞的氧化应激反应。3、统计分析采用均值检验比较各染毒组ROS、微核和尾部DNA百分比,规定P<0.05(双侧)为具有统计学差异。二、结果:1、AFB1和MC-LR联合暴露对L02细胞遗传毒性随着两者联合毒性剂量的增加,细胞尾部DNA百分比及微核形成率均显著升高。联合高剂量组(AFB1 10mg/L联合MC-LR 10mg/L)染毒组微核形成率和尾部DNA百分比分别为41.33±7.78%和18.19±15.06%,而对照组(DMSO组)微核形成率和尾部DNA百分比分别为5.00±2.00%和1.03±0.59%。2、AFB1和MC-LR联合暴露对L02细胞ROS表达的影响在较低剂量时,随着两种毒素联合剂量的增加,ROS的表达逐渐升高;在较高剂量时,随着两种毒素联合剂量的增加,ROS的表达逐渐降低。三、结论:AFB1和MC-LR联合染毒对肝细胞具有协同致DNA损伤作用,其重要机制是造成细胞ROS的改变。全文总结:本研究发现涪陵地区生活的居民存在AFB1和MC-LR的暴露,并且是两个镇肝肾损伤的重要原因;相比较AFB1和MC-LR而言,HBV仍然是最主要的人群肝损伤危险因素,并且HBV会显著增加AFB1和MC-LR造成的肝损伤;MCs是最主要的肾损伤危险因素,AFB1肾损伤并不明显,两者联合后主要表现为MCs引起的肾损伤;AFB1和MC-LR具有协同致肝L02细胞DNA损伤的效应,其主要机制之一是通过导致细胞ROS改变。创新点:1、本研究在同一人群中,比较了三种主要肝损伤因素的损伤效应,并对三种因素的联合作用进行了分析,发现HBV是作用强于AFT和MC的肝损伤危险因素,并且HBV能够显著增加AFT和MC引起的肝损伤。我们的研究为三种肝损伤因素危害性的确定及两种毒素易感人群的探寻提供了新的理论依据。2、本研究首次在人群层面确定了两种毒素暴露与肾损伤的关联性,研究结果表明MC是强于AFT的肾损伤危险因素。本研究为慢性肾疾病的发病原因探索提供了新的角度。3、本研究首次在细胞层面对两种毒素的联合毒性作用进行了探索,发现AFT和MC均会造成细胞DNA的氧化损伤,并且两种毒素联合染毒后对细胞的DNA损伤作用明显强于单独因素,结果提示两种毒素具有协同遗传毒性作用。本研究为两种生物毒素的协同毒性作用机制提供了实验依据。以上内容经文献检索,国内外均未见类似的研究报道。局限性:本研究也存在一些局限性。首先,由于经费原因,我们并没有检测血清中所有的肝、肾功能生物标志物;其次,我们检测了MCs中的MC-LR,AFT中的AFB1,没有检测到微囊藻毒素和黄曲霉毒素的所有亚型,这将低估人群对这两种毒素的暴露量;第三,尽管我们在分析的时候矫正了一些肝、肾损伤的危险因素,但是并没有能够矫正所有的相关危险因素;最后,尽管我们发现ROS是两个毒素发生协同损伤效应的重要原因之一,但是还有其他多条途径可能参与了两个毒素的毒性过程,这还需要未来更多的研究证实。未来计划:在未来的工作中,我们将进一步分析涪陵地区人群中毒素暴露与代谢疾病的关系;并对建立的队列人群进行健康追踪回访,以便长期关注他们的健康情况;另外,对于两个毒素发生协同效应的机制还可进行更加深入的探讨。