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鸡球虫病是由多种艾美尔球虫引起的具有严重危害的寄生虫病,其中以柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)致病力最强,每年给养鸡业造成巨大经济损失。对球虫进行防控,最有效的方法是阻断其入侵,所以筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质是阐明球虫致病机理从而进行有效防控的首要任务。球虫入侵过程复杂,许多蛋白质如棒状体蛋白、微线蛋白和表面抗原蛋白等已被证明与球虫入侵相关。有研究表明分泌蛋白在球虫入侵过程中可能发挥重要作用,对入侵相关分泌蛋白进行研究将有助于筛选鉴定球虫入侵关键蛋白质,加深对球虫入侵机理和球虫-宿主之间互作机制的了解,并为制备更有效的抗球虫药物或疫苗提供更多重要参考数据。本研究通过TMT标记定量蛋白质组学技术对E.tenella体外入侵DF1细胞的相关分泌蛋白进行了系统筛选鉴定,并对2个E.tenella入侵相关蛋白质SAG14和EF1α进行了功能初步分析。本研究主要分为以下四个部分:1.柔嫩艾美尔球虫体外入侵DF1细胞分泌蛋白质组学分析为对球虫入侵机理及球虫-宿主细胞之间互作机制进行深入研究,筛选鉴定入侵相关蛋白质成为研究重点。本研究以未感染细胞的子孢子分泌蛋白为对照,通过TMT标记子孢子入侵DF1细胞0.5 h、1 h和2 h三个时间点的分泌蛋白进行定量蛋白质组学分析。结果显示,共定量到208个有效蛋白,其中153个差异蛋白,包括82个上调蛋白和71个下调蛋白。对差异蛋白进行统计分析,结果显示鉴定到15个共同表达上调蛋白和9个共同表达下调蛋白。对差异蛋白进行GO二级注释和亚细胞结构定位分类分析,结果显示,差异蛋白主要集中在细胞过程和代谢过程等生物进程,主要参与细胞、细胞器和大分子复合物等细胞组成,在入侵过程中主要发挥催化活性、粘附连接、结构分子活性、抗氧化活性和运输活动等分子功能,并且主要定位在细胞外和细胞质等部位。2.qPCR与Western blot验证组学结果本研究通过qPCR与Western blot两种方法相结合的方式验证了组学结果的可靠性。首先挑选12个差异蛋白设计qPCR引物进行验证,结果显示12个差异蛋白中有10个蛋白在mRNA转录水平与蛋白表达水平具有一致性,符合率为83.33%,初步验证了组学结果的可靠性。之后选取组学结果中表面抗原14(SAG14)、延伸因子1α(EF1α)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN1)作为Western blot验证蛋白,主要进行了基因克隆、蛋白表达与纯化、多克隆抗体制备。以ACTIN抗体作为内参抗体进行Western blot验证,结果显示SAG14、EF1α和SERPIN1为分泌蛋白,符合率为100%,进一步验证了组学结果的可靠性。3.入侵相关蛋白SAG14功能初步探究有研究表明表面抗原蛋白在球虫入侵过程中可能具有重要作用,本研究选取组学结果中的SAG14分泌蛋白进行功能初步探究,包括生物信息学分析、子孢子定位、细胞粘附作用、体外入侵阻断作用和动物免疫保护力评价。生物信息学分析结果显示,SAG14具有信号肽和跨膜区;子孢子定位结果显示SAG14定位在子孢子表面;将SGA14展示在酵母表面对细胞进行粘附,结果显示表面展示有SAG14的酵母菌与对照组(16.22%±2.84%)相比对细胞有更加显著的粘附作用,粘附率为41.89%±2.38%;体外入侵阻断试验结果表明SAG14抗体可显著降低入侵细胞的子孢子数量,最高抑制入侵率为48.40%±3.98%。通过动物试验对SAG14免疫保护力进行评价,结果显示雏鸡在免疫SAG14重组蛋白后,可显著降低因感染E.tenella造成的雏鸡体重减轻情况,减轻雏鸡盲肠病变并减少卵囊排出量,经计算SAG14抗球虫指数为142.20,抗球虫效果为中等有效,ELISA分析结果显示雏鸡感染E.tenella可刺激雏鸡产生高滴度SGA14抗体抵抗球虫入侵,显示SAG14对雏鸡具有部分免疫保护效果。4.入侵相关蛋白EF1α功能初步探究选取组学结果中EF1α分泌蛋白进行功能初步探究,包括生物信息学分析、子孢子定位、细胞粘附作用、体外入侵阻断作用和动物免疫保护力评价。生物信息学分析结果显示,EF1α有临时延伸因子1α功能的PTZ00141保守结构域;子孢子定位表明EF1α可定位在子孢子表面;将EF1α展示在酵母表面对细胞进行粘附,结果显示表面展示有EF1α的酵母菌与对照组(16.22%±2.84%)相比对细胞粘附效果更加显著,粘附率为35.00%±4.32%;体外入侵阻断试验结果显示EF1α抗体可显著降低入侵细胞的子孢子数量,最高抑制入侵率为42.07%±4.46%。通过动物试验对EF1α的免疫保护力进行评价,雏鸡免疫EF1α重组蛋白后,结果表明可显著降低因感染E.tenella造成的雏鸡体重减轻情况,减轻感染雏鸡盲肠病变同时降低卵囊排出量,经计算EF1α抗球虫指数为165.53,抗球虫效果为良好,ELISA分析结果显示雏鸡感染E.tenella可诱导雏鸡产生高滴度EF1α抗体抵抗球虫入侵,显示EF1α对雏鸡具有部分免疫保护效果。本研究通过TMT标记定量蛋白质组学技术对E.tenella体外入侵DF1细胞的分泌蛋白进行了系统性分析,共筛选鉴定到153个差异显著蛋白,包括82个上调蛋白和71个下调蛋白。验证SGA14、EF1α和SERPIN1为分泌蛋白,对分泌蛋白SGA14和EF1α进行功能初步探究发现其均与子孢子粘附与入侵相关,并对雏鸡具有部分免疫保护力。