背景与目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞恶性增生性疾病，约占血液恶性肿瘤的10％。单药用于难治性MM效果欠佳，大多数单药化疗的有效率非常低。联合化疗以及新的药物如沙利度胺和硼替佐米的使用仍达不到理想的疗效。自体造血干细胞移植虽可使部分患者病情缓解，但费用高，最终疾病仍要复发。异基因造血干细胞移植是治愈MM的根本手段，但因患者年龄较大、缓解率低、缺乏HLA相合的供者，移植相关病死率高，限制了它的应用。由于上述原因，到目前为止，MM仍被认为是不可治愈的疾病。因此，临床需要寻找治疗骨髓瘤的新方法。自体干细胞移植后输注KIR(抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)-错配的异基因自然杀伤细胞(Allo-reactive Natural Killer，Allo-NK)作为新的生物治疗方法可以清除残留的肿瘤细胞，避免移植后疾病复发，延长生存期。　　 在异基因造血干细胞移植中，同种异体反应性自然杀伤细胞有提高白血病治愈率的作用。最近研究显示，Allo-NK细胞对原代的胃癌、恶性黑色素瘤、肾癌、肠癌和卵巢癌细胞也有杀伤作用。但是，Allo-NK细胞对骨髓瘤细胞的作用尚待研究。　　 NK细胞是遗传性免疫系统的主要效应细胞，对病原感染的或变异的细胞具有自然细胞毒效应，NK细胞表面表达的受体与靶细胞表面的配体通过遗传模式识别发挥效应。NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(inhibitorykiller cell immunoglobulin-like receptor，KIR)与靶细胞表面特定的HLA-Ⅰ类分子结合，介导对NK细胞毒活性的抑制效应，靶细胞缺乏KIR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性。NKG2D是NK细胞表面的主要活化性受体；其配体为MHC-Ⅰ类链相关分子A或B(MHC class I chain-related molecule A or B，MICA/B)及人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白(human cytomegalovirus glycoprotein UL16binding proteins，ULBPs: ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D和肿瘤细胞表面的相应配体结合，介导NK细胞的杀伤效应。异基因造血干细胞移植中，当存在供者到受者方向的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体.配体错配时，供者的同种反应性NK细胞介导的抗白血病效应可以防止白血病复发。体外实验证实NK细胞能抑制慢性粒细胞白血病患者白血病CD34+细胞形成粒细胞巨噬细胞集落形成单位，表明NK细胞对白血病细胞和白血病克隆形成细胞具有杀伤效应。有研究证实，KIR-配体错配的NK细胞可有效地杀伤原代的胃癌、肾癌、肠癌、卵巢癌肿瘤细胞，而无KIR-配体错配的NK细胞不具有杀伤活性。　　 依据骨髓瘤的起源、病因、发病机理、生物学行为和对NK细胞功能的揭示，本研究以人骨髓瘤RPMI8226细胞和Allo-NK细胞混合培养为反应体系，以对NK细胞杀伤活性高敏感性的K562细胞做对照来探讨：①Allo-NK细胞对骨髓瘤RPMI8226细胞的杀伤活性；②其相关分子基础是什么；③能否通过调节，提高RPMI8226细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性。本研究旨在寻找新的骨髓瘤牛物治疗方法，并其提供理论和实验依据。　　 方法:　　 第一部分人骨髓瘤RPMI8226细胞的生物学特性　　 观察光镜下RPMI8226细胞形态、生长特点，体外克隆形成率；流式细胞仪分析细胞周期分布、多药耐药蛋白P.170及ABCG2的表达。　　 第二部分 NK细胞对骨髓瘤RPMI8226细胞的体外杀伤活性　　 免疫磁珠法分离纯化5例健康者的NK细胞，体外IL2培养24h，作为效应细胞。以体外培养的K562和RPMI8226细胞为靶细胞，LDH释放法检测不同效靶比时5例健康者的NK细胞对其的杀伤活性，确定20:1为最佳效靶比，进一步观察20:1时NK细胞对K562和RPMI8226细胞体外克隆形成的影响。　　 第三部分骨髓瘤RPMI8226细胞体外逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步研究　　 以QIAampDNA抽提试剂提取RPMI8226细胞和健康志愿者的NK细胞的DNA； PCR-SSP法测定健康志愿者NK细胞KIR基因型。采用序列特异性引物扩增法分析RPMI8226细胞HLA Ⅰ类分子基因型(sequence specific primer　　 polymerase chain reproduction，PCR-SSP)。RT-PCR检测K562和RPMI8226细胞NKG2D配体基因的表达情况，流式细胞仪检测其细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达情况。流式细胞仪及细胞免疫组化法检测K562和RPMI8226细胞表面NKG2D配体的表达情况。观察效靶比20:1时阻断不同的NKG2D配体及HLA-Ⅰ类分子NK细胞对K562和RPMI8226细胞杀伤活性的影响。　　 第四部分提高骨髓瘤RPMI8226细胞对NK细胞杀伤敏感性　　 以热疗、三氧化二砷、硼替佐米处理的RPMI8226细胞为靶细胞，观察效靶比20:1时RPMI8226细胞对NK细胞杀伤敏感性的变化，流式细胞仪检测处理后RPMI8226细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达情况。　　 结论:　　 1、RPMI8226细胞是恶性细胞。　　 2、RPMI8226细胞对NK细胞的杀伤具有低敏感性。　　 3、RPMI8226细胞对NK细胞的杀伤敏感性低与其表面低表达NKG2D配体和高表达HLA-Ⅰ类分子有关。　　 4、NK细胞对RPMI8226细胞的杀伤是受HLA-KIR和NKG2D-NKG2DL双信号调节的。　　 5、热疗和低剂量三氧化二砷可以提高NK细胞对RPMI8226细胞的杀伤敏感性。　　 6、热疗和低剂量三氧化二砷是通过提高RPMI8226细胞表面的NKG2D配体表达而使NK细胞的杀伤活性增加。