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目的:
本实验通过观察种植器件上皮邻接面不同纳米级尺寸的微结构对人牙龈上皮细胞生物学行为的影响,筛选出有利于种植器件与周围软组织之间形成良好生物封闭的关键微结构,阻挡细菌的入侵,避免炎症的发生发展,为种植体颈部材料的设计提供理论依据,从而提高种植修复的成功率。
方法:
1.种植器件上皮邻接面微结构的制备:将具有纳米级孔洞阵列结构的阳极氧化铝(AAO)模板作为母版,将聚二甲基硅氧烷(PDMS)的基料和催化剂按质量比10∶1混合,并浇铸于母版上,经真空排气、甩胶、加热固化后,复制出具有规则点阵结构的软模板。采用扫描电镜观察微结构样品的表面结构形态。选取100nm、200hm和500nm三种不同尺寸的微结构模板作为实验组,镜面光滑的模板作为对照组。
2.将牙龈上皮细胞分别接种于不同的微结构表面,进行体外复合培养。采用CCK-8法检测细胞在1天、3天和5天的细胞增殖情况;采用扫描电镜观察表面细胞的形状及排列;用激光共聚焦显微扫描技术对上皮细胞骨架F-actin进行形态学观察。
结果:
1.细胞增殖情况:牙龈上皮细胞在PDMS材料表面第1天、3天和5天的CCK-8吸光值(OD值),间接反映了细胞的增殖情况。第1天、3天和5天,牙龈上皮细胞在各组微结构材料表面的OD值高于其在对照组材料表面的OD值,在各时期的差异具有统计学意义(P<0.05);细胞在100nm组微结构表面的OD值高于其他实验组别,差异在1天、3天和5天均具有统计学意义(P<0.05);细胞在200hm组和500nm组材料表面的OD值没有显著性差异(P>0.05)。
2.细胞在微结构模板表面的形状排列:扫描电镜观察100nm组的上皮细胞铺展良好,表面有很多微绒毛和细胞皱褶,伸出长的伪足;200hm和500nm组的细胞铺展良好,细胞表面有微绒毛,细胞相邻面可见皱褶,有小伪足伸出;对照组的细胞为完全铺展,边界清晰,少见微绒毛和皱褶,未见明显的伪足伸出。
3.微结构模板表面上皮细胞骨架F-actin的表达情况和分布:激光共聚焦观察100nm组的F-actin清晰,丝丝分明,绿色荧光强,细胞中央见不规则纤维丝,也围绕于细胞周边,呈束状相互连接;200nm和500nm组,细胞中央未见明显的纤维丝,但细胞周边可见纤维丝的分布;对照组的绿色荧光较弱,没有明显的细丝状结构,偶见细胞周边有纤维丝表达。
结论:
1.PDMS软模板具有良好的生物相容性,牙龈上皮细胞能在不同尺寸微结构的PDMS样品表面附着增殖,是分析表面微结构对细胞行为影响研究的理想生物材料。
2.改良的上皮细胞培养方法能快速、成功地培养出入原代牙龈上皮细胞,其1~2代传代细胞的形态与原代细胞相似,成功建立了人牙龈上皮细胞的体外培养体系。
3.表面具有纳米级规则点阵突点的微结构材料,尤其是突点直径为100nm的微结构,有助于牙龈上皮细胞的附着增殖,为研究微结构形貌影响细胞粘附增殖的机制和种植器件颈部材料的设计提供实验依据。