研究背景： 脑梗死后神经再生和血管增生机制尽管尚未明确，但可能与神经生长因子、神经营养因子、促红细胞生成素、Notch通路等有关。本课题组前期研究发现，干预EphB2可促进SVZ Nestin阳性细胞活化，提示EphB2可能是脑梗死后细胞增殖的调节因素。然而，这些增殖细胞是否具有向神经元分化的潜能、梗死灶周神经再生以及EphB2是否调节脑梗死后血管增生尚未明确。此外，EphB2对脑梗死后远隔部位细胞增生和血管新生的作用如何？本研究拟在前期工作基础上进一步阐明这些问题。 研究目的： 本课题拟首先观察局灶性大脑皮层梗死后内源性神经再生和血管增生情况；进而利用渗透性微泵持经侧脑室持续给予外源性EphB2-Fc，评估干预EphB2对大脑皮层脑梗死后神经功能的影响；探讨EphB2对大脑皮层梗死后SVZ、梗死灶周和远隔部位神经再生的调节作用；进而探讨EphB2对脑梗死后SVZ、梗死灶周及丘脑血管增生的可能作用。因此，本研究有助于揭示脑梗死后神经再生和血管增生的可能调节靶点，并为脑梗死后促进神经功能恢复提供实验依据。 材料和方法： 采用体重70～90g SD大鼠240只按照本课题组方法建立易卒中型肾性高血压大鼠模型。RHRSP术后10周，选取血压>180mmHg，且无自发性脑卒中表现的高血压大鼠198只建立右侧大脑中动脉皮层支闭塞模型。MCAO术后24h随机选取6只进行TTC显色以明确梗死灶位置和分布。按照随机化原则分为4组：MCAO组、MCAO+EphB2-Fc组和IgG—Fc组；假手术组大鼠仅暴露大脑中动脉而不凝闭。MCAO术后24h MCAO+EphB2-Fc组大鼠利用渗透性微泵经侧脑室给予重组小鼠EphB2-Fc；IgG—Fc组大鼠采用同样方法给予相同剂量的重组人IgG—Fc作为对照。 各组大鼠MCAO术后7d、14d和21d分别进行神经功能评分后选取8只取材后进行冰冻切片。Nissl染色评估梗死灶体积：免疫组织化学方法观察EphB2、ephrinB2的表达以及侧脑室注射后外源性EphB2-Fc在脑内的分布；免疫荧光检测各组大鼠MCAO术后不同时间点SVZ BrdU、BrdU/Nestin、BrdU/DCX、BrdU/GFAP、BrdU/NeuN和PSA—NCAM阳性细胞数；梗死灶周和同侧纹状体BrdU、BrdU/NeuN阳性细胞及丘脑BrdU阳性细胞；检测SVZ、梗死灶周及丘脑BrdU/Laminin阳性细胞评价血管内皮细胞增殖。 全部数据采用SPSS11.5 for windows统计软件包进行统计分析。 结果： 1.TTC显色 为明确梗死灶的位置和范围，MCAO术24h随机选取6只大鼠进行TTC显色. 2.EphB2的表达及外源性EphB2-Fc的分布 免疫组化结果显示：EphB2表达于SVZ，细胞形态较小，沿侧脑室壁分布，MCAO术后7d、14d同侧SVZ EphB2表达水平较假手术组明显减少，其后逐渐升高，MCAO术后21d恢复至假手术组水平。免疫荧光双标显示：梗死灶同侧SVZ EphB2表达于BrdU+细胞；EphB2配体ephrinB-2表达于vWF阳性血管。经侧脑室注射EphB2-Fc后免疫荧光。 3.EphB2-Fc对脑梗死后神经功能和梗死灶体积的影响 MCAO术前1周和术后1、2、3周各组大鼠采用神经功能严重程度评分和平衡木行走试验分别评价总体神经功能严重程度和运动平衡功能。假手术组大鼠未见任何神经功能缺损。MCAO组大鼠术后7d、14d和21d NSS和平衡木试验评分显示大鼠神经功能明显低于假手术组。 4.EphB2-Fc与脑梗死后SVZ神经再生和血管增生 4.1.EphB2-Fc与脑梗死后SVZ细胞增殖 免疫荧光检测BrdU阳性细胞评价新生细胞。结果显示：MCAO术后各时间点MCAO和IgG—Fc组大鼠同侧SVZ BrdU阳性细胞数均无显著差异。 4.2.EphB2-Fc与脑梗死后SVZ新生细胞表型 免疫荧光检测同侧SVZ增殖细胞Nestin、DCX、GFAP和NeuN的表达评价新生细胞向神经或胶质细胞分化情况。Nestin主要表达于神经干细胞，结果显示：MCAO术后同侧SVZ存在少量BrdU+/Nestin+细胞，沿SVZ侧壁和前角分布。EphB2-Fc干预后梗死灶同侧SVZ BrdU+Nestin+细胞明显增加。 4.3EphB2-Fc与脑梗死后细胞迁移 免疫荧光检测嗣侧SVZ PSA—NCAM+细胞，结果显示：假手术组SVZ前角存在少量PSA—NCAM+细胞。MCAO术后PSA—NCAM+细胞增多，并以SVZ前角周围最为明显，并可见PSA—NCAM+细胞沿胼胝体向梗死灶方向迁移。EphB2-Fc组梗死灶同侧SVZ前角和胼胝体下PSA—NCAM+细胞显著增多，可见大量PSA—NCAM+/BrdU+细胞。 4.4.EphB2-Fc与脑梗死后SAZ血管内皮细胞增殖 BrdU标记增殖细胞，Laminin标记血管，BrdU+/Laminin+细胞则提示血管内皮细胞增殖。结果显示：假手术组梗死灶同侧SVZ未见BrdU+/Laminin+细胞。 4.5.EphB2-Fc与脑梗死后SVZ血管密度 采用FITC—dextran显示微血管密度和血管通透性。结果显示：MCAO术后梗死灶同侧SVZ侧壁、前角及胼胝体处血管密度较假手术组有所增多；而EphB2-Fc干预后梗死灶同侧SVZ可见大量绿色荧光显示的血管。 5.EphB2-Fc与梗死灶周神经再生和血管增生 5.1.EphB2-Fc与梗死灶周神经再生 采用BrdU、NeuN分别检测增殖细胞和成熟神经元，BrdU+/NeuN+细胞则提示新生成熟神经元。结果显示：MCAO术后脑梗灶周存在少量BrdU+细胞。 5.2.EphB2-Fc与梗死灶周血管内皮增殖 假手术组大鼠几乎未观察到BrdU+/Laminin+细胞，而MCAO术后梗死灶周BrdU+/Laminin+细胞增多；经侧脑室EphB2-Fc干预后梗死灶周BrdU+/Laminin+细胞数较IgG—Fc组大鼠明显增多。 5.3.EphB2-Fc与梗死灶周血管密度 假手术组大鼠大脑皮层可见正常血管分布。MCAO术后梗死灶中心无血流灌注，而且梗死灶周血管密度显著下降：EphB2-Fc干预后梗死灶周血管密度较IgG—Fc对照组显著增多，而且血管增生区血管周可见明显FITC—dextran荧光。 6.梗死灶周神经可塑性 Western blot检测SYN和GAP—43评价梗死灶周轴突再生。结果显示：MCAO术后2周时梗死灶周SYN和GAP—43表达较假手术组均明显增多，而MCAO术后3周时逐渐降低至假手术组水平；EphB2-Fc干预组大鼠MCAO术后2周时梗死灶周SYN和GAP—43表达均显著高于IgG—Fc组。 7.远隔部位血管增生和细胞增殖 7.1.EphB2-Fc与梗死灶同侧丘脑血管内皮细胞增殖 假手术组丘脑腹后核未见明显BrdU+/Laminin+细胞，而MCAO术后梗死灶同侧VPN存在少量BrdU+/Laminin+细胞。 7.2.EphB2-Fc与梗死灶同侧丘脑血管密度 FITC—dextran显示VPN微血管密度和血管通透性。结果显示：MCAO术后3周内梗死灶同侧VPN血管密度较假手术组均明显增多；EphB2-Fc干预后梗死灶同侧VPN血管密度较IgG—Fc组显著增多，而且血管密度的增加在MCAO术后1周时较为明显，术后2周达到高峰，并可持续至MCAO术后3周；高倍镜下血管增生区血管周可见明显FITC—dextran荧光。 7.3.EphB2-Fc与梗死灶同侧丘脑细胞增殖 免疫荧光检测脑梗死后同侧VPN BrdU+细胞。结果显示：假手术组丘脑VPN几乎未观察到BrdU+细胞，而MCAO术后1周梗死灶同侧VPN BrdU+细胞明显增多；EphB2-Fc干预后同侧VPN BrdU+细胞显著多于IgG—Fc组，而且BrdU阳性细胞多分布在血管周。BrdU阳性细胞计数显示：MCAO术后3周内同侧VPN BrdU+细胞较假手术组均明显增加；EphB2-Fc干预后梗死灶同侧VPN BrdU+细胞较IgG—Fc组显著增加，术后14d时增加最为明显，其后逐渐下降，但在MCAO术后21d仍高于IgG—Fc组。 结论： 1.大脑皮层梗死后SVZ、梗死灶周存在神经再生；EphB2-Fc干预后明显促进梗死灶同侧SVZ细胞增殖、迁移、分化以及梗死灶周神经再生，表明EphB2调节脑梗死后神经再生。 2.大脑皮层梗死后SVZ、梗死灶周存在血管增生；EphB2-Fc能够促进同侧SVZ和脑梗死灶周血管内皮细胞增殖、增加血管密度，提示EphB2参与脑梗死后血管增生。 3.大脑皮层梗死后同侧丘脑也存在细胞增殖和血管增生；EphB2-Fc能够促进梗死灶同侧丘脑血管内皮增殖、增加血管密度，表明EphB2也是脑梗死后远隔部位血管增生和细胞增殖的重要调节因素。 4.EphB2-Fc可显著改善脑梗死后神经功能，其机制可能与其干预EphB2后促进神经再生和血管增生有关。