一、背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是临床诊断中常见的高发性,高致死率的恶性肿瘤,在恶性肿瘤死亡率中位居第三。全球每年约有100万人被诊断出患有肝细胞癌,其中约有75%的肝细胞癌患者具有慢性肝炎B病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染背景。我国是肝细胞癌的高发地区,由HBV引发的HCC在我国的发病率居世界第一。因此,HBV相关的慢性肝炎,肝硬化及其诱发的肝细胞癌仍将是中国内地未来40-50年主要的公共卫生问题。肝内的一切生物化学反应,都需要肝细胞内各种酶系统的参加。肝脏病变会导致代谢酶功能的改变直接影响营养物质、致癌物以及药物的代谢,研究HCC患者肝细胞内药物代谢酶的变化,从中掌握其变化的规律,为肝癌治疗的合理用药以及肝癌的早期诊断提供一定的实验数据。磺基转移酶(SULT)在人体起着重要的生物转化作用,参与转化内源性物质、药物和食物等,并与HCC的进展密切相关。SULT1A家族主要参与酚类的磺酸化代谢,主要划分为3个亚家族,包含至少11种亚型,其中SULT1A1是肝脏中含量最高的SULT代谢酶,并且参与多种重要的酚类药物的代谢,如对硝基苯酚、米诺地尔和17-α-炔雌醇等。而SULT1A3则主要参与儿茶酚胺类药物的代谢,如多巴胺和去甲肾上腺素等,虽然其在肝脏中的含量非常少,但是SULT1A3却可能是人类区别于其他灵长类动物特有的代谢酶亚型,目前在其他物种身上没有发现类似的亚型。有目的性地选择研究这两种SULT亚型,掌握其在癌旁组织和肿瘤组织的变化规律,尤为重要。二、方法本实验的研究主要集中于10例HCC患者的肝组织,研究在HCC患者的癌旁肝组织和肿瘤肝组织中,SULT1A1和SULT1A3的活性、蛋白表达和mRNA表达的差异。为研究HCC状态下代谢酶的活性变化,本实验选取SULT1A1的特异性底物—对硝基苯酚,SULT1 A3的特异性底物—多巴胺,以特征性底物在磺酸化代谢体系中生成代谢产物的速率来分别评价两种酶的代谢活性。同时,选取在肝脏中主要被SULT1A1代谢的染料木素,以及磺酸化代谢产物可能主要由SULT1A3催化生成芹菜素这两种黄酮类化合物,从不同的角度来研究这两种酶亚型在HCC肝组织的催化能力的变化。为进一步研究药物代谢酶在HCC组织中的差异及其催化能力发生改变的初步分子机制,本实验采用蛋白免疫印迹法(Western blot),利用多克隆或者单克隆抗体与酶蛋白特异性结合的特性,考察SULT1A1和SULT1A3的在癌旁和肿瘤组织的蛋白表达量的差异与变化规律。DNA转录为RNA后,由RNA翻译成蛋白质,追溯蛋白质发生改变的机制,很可能是因为DNA转录RNA的数量改变,为验证这一推测,本实验利用RT-PCR的技术,设计SULT1A1和SULT1A3的特定引物,以β-actin为管家基因,进行目的基因的实时荧光定量,从而研究mRNA表达的变化差异。本论文涉及的技术和手段:1.人肝脏S9的制备与总蛋白浓度的测定经南方医院道德与伦理委员会批准,HCC患者外科手术后,取部分肝组织样本保存于冰冻生理盐水中,并与半小时内于冷库进行肝组织S9的制备。原发性肝细胞癌样本包膜完整,毗邻肝癌包膜外的组织人为定义为癌旁组织,分离癌旁组织与肿瘤组织(弃包膜),采用差速离心法制备S9。制备完成后,采用Bradford法(Bio-Rad,Hercules,CA)测定蛋白含量。以等倍稀释的牛血清蛋白为标准样,考马斯亮蓝法,吸收波长为595 nm,酶标仪测定,计算出总蛋白浓度。2.磺酸化Ⅱ相代谢反应体系参考已发表的文献,400 μl的反应体系中包括pH为7.4的磷酸盐缓冲液(KPI)358.4 Adenosine 3-phosphate 5-phosphosulfate(PAPS,2mM)20 S9 Fraction 21.2 μl和药物4 于37℃ 50 rev/min,水浴30-90分钟,去蛋白后,离心,分析。3.UPLC与LC/MS/MS对代谢产物的定量及鉴定建立灵敏且特异性强的UPLC方法,对磺酸化代谢产物和原型分离,并采用DAD或者MS进行定量分析。同时,采用质谱全扫描和二级质谱方法,提取分子量,鉴定代谢产物。4.酶代动力学数据分析及统计学分析以形成代谢产物代谢速率与底物浓度的比值为横坐标,生成代谢产物代谢速率为纵坐标作Eadie-Hofstee图,根据Eadie-Hofstee图的情况判定为典型米氏方程模型或非典型动力学模型,采用ADAPT Ⅱ软件进行拟合,为找出最合适的模型,采用阿开克(氏)信息判据(Akaike’s information criterion,AIC)对各个侯选模型进行判别,并应用简约性原则(the rule of parsimony)选择最佳模型,经软件拟合后得酶动力学参数。本文涉及代谢速率的比较均采用SPSS 13.0两独立样本t检验(independent-Samples T-test)进行统计学分析。5.蛋白免疫印迹法(Western blot)测定酶亚型在HCC样本癌旁及肿瘤组织的蛋白表达水平电泳将各目标蛋白分离,将蛋白转印至PVDF膜上,与特异性抗体孵育过夜,目标蛋白与特异性抗体结合后与带有荧光标记的二抗孵育,二抗与一抗结合,于暗室曝光,即可检测目标蛋白的量。采用Quantity one进行光密度值定量,Photoshop进行图片整理,SPSS13.0进行统计分析。6.实时荧光定量PCR(RT-PCR)测定酶亚型在HCC样本癌旁及肿瘤组织的mRNA表达水平PCR(聚合酶链反应)是用于放大只有目标基因片段的微量DNA,通过重复3步的循环DNA热变性,引物退火和延伸,目标基因片段可能使用DNA聚合酶快速放大一百万倍的一种技术。按照Purelink RNA mini kti(Invitrogen)试剂盒的实验方法,从人肝细胞癌肿瘤组织及癌旁肝组织,在10例HCC样本中提取总 RNA。采用 Super Script Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒,依据其实验方法,合成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒,按照其实验步骤,以β-actin作为管家基因,在ABI PRISM 7500 PCR上进行目的基因的实时荧光定量。三、结果1.正常人肝S9、癌旁组织及肿瘤组织S9对SULT1A1底物对硝基苯酚的酶代动力学研究正常人肝S9(BD)、混和的癌旁组织S9和肿瘤组织S9对对硝基苯酚的代谢动力学,均符合Substrate Inhibition动力学的特点,运用ADAPT Ⅱ动力学模拟软件计算出的参数,Commercial S9 和 pooled-PS9 的 分别为(190.12±22.69 vs.185.42±28.62pmol/min/mg),株分别为(2.58±0.69 vs.2.19±0.44 μM)无显著性差异,而 pooled-TS9 的 Vmax 为 71.70±8.27 pmol/min/mg,Km为1.62±0.32 μM,明显低于正常和癌旁的混合S9。从10例单独样本的高中低三个浓度的代谢情况比较,得到与酶代动力学参数一致的结果,即在同一样本中,癌旁组织的代谢速率显著高于肿瘤组织。2.正常人肝S9、癌旁组织及肿瘤组织S9对SULT1 A3底物多巴胺的酶代动力学研究多巴胺由SULT1A3催化代谢生成的两个代谢产物:Dopamine-3-0 sulfate和 Dopamine-4-O sulfate。运用 ADAPT Ⅱ 动力学模拟软件计算 Dopamine-4-O sulfate的酶代动力学参数,Commercial S9和pooled-PS9的Vmax分别为(4.62±2.14 vs.1.92±1.48 pmol/min/mg),无统计学差异,而 pooled-TS9 的 Vmax为 9.40±0.77 pmol/min/mg,显著高于 Commercial S9 和 pooled-PS9 两组,有统计学差异。磺酸化代谢体系中,Dopamine-3-0 sulfate占代谢产物总量的90%以上,其代谢率在肿瘤组织显著高于正常人肝S9和癌旁组织S9。在9例HCC单独样本,高中低三个浓度组中,Dopamine-3-0 sulfate和Dopamine-4-0 sulfate的代谢速率变化均是,NO.1、3、5、6、7、9样本中肿瘤组织的代谢速率显著高于对应的癌旁组织,而NO.8则反之。3.正常人肝S9、癌旁组织及肿瘤组织S9对染料木素的酶代动力学研究染料木素在人肝S9体系有两个磺酸化代谢产物,其主要磺酸化代谢产物为7位羟基与磺酸基结合生成的Genistein 7-O-sulfate,占代谢产物总量的90%以上。在人肝S9体系中,染料木素260nm的转换因子为0.86±0.07。正常人肝S9、癌旁和肿瘤组织S9对染料木素的代谢动力学,均符合Substrate Inhibition动力学的特点,运用ADAPT Ⅱ动力学模拟软件计算,Commercial S9和pooled-PS9的代谢速率明显大于pooled-TS9。选取高中低三个浓度,研究10例HCC单独样本癌旁组织S9和肿瘤组织S9的代谢速率,结果显示,除NO.9和NO.10外,肿瘤组织对染料木素的代谢速率显著低于癌旁组织。4.正常人肝S9、癌旁组织及肿瘤组织S9对芹菜素的酶代动力学研究芹菜素在人肝S9体系有1个磺酸化代谢产物,为一个羟基上结合了磺酸基团,但目前无文献报道该代谢产物磺酸基的位置,340nm的转换因子为0.52±0.06。正常人肝S9、癌旁和肿瘤组织S9对芹菜素的代谢动力学均符合“经典米氏方程(Michaelis-Menten)”,运用ADAPT Ⅱ动力学模拟软件计算动力学参数,Commercial S9、pooled-PS9 和 pooled-TS9 的Vmax依次为 18.14±1.37、13.64±1.07、42.26±3.32 pmol/min/mg,肿瘤组织的代谢速率显著高于正常和癌旁组织S9。研究芹菜素在10例HCC单独样本中的代谢速率差异,结果显示,NO.1、2、4、7、9例样本中肿瘤组织对芹菜素的代谢速率明显高于癌旁组织,而NO.3、5、8、10则相反,NO.6无明显趋势。5.HCC癌旁组织及肿瘤组织中SULT1A1和SULT1A3的蛋白表达水平差异研究SULT1A1的一抗浓度为1:250,二抗浓度为1:2000,封闭时间为1 h,34 kd处为SULT1A1的条带,43 kd为β-actin的条带,其在10例HCC样本中,癌旁组织的蛋白表达量显著高于肿瘤组织,且差异较大。SULT1A3的一抗浓度为1:500,二抗浓度为1:1000,封闭时间为0.5 h,34 kd处为SULT1A3的条带,43 kd为β-actin的条带,其在10例HCC样本中,除N0.5和N0.8之外,肿瘤组织的蛋白表达量显著高于癌旁组织。6.HCC癌旁组织及肿瘤组织中SULT1A1和SULT1A3的mRNA表达水平差异研究SULT1A1的基因表达量的相对计算,以癌旁组织的表达量为1,肿瘤组织则是相对表达量,在10例HCC样本中,癌旁组织的基因表达量均显著高于肿瘤组织。而SULT1A3的基因表达量,在10例HCC样本中,NO.1、2、3、5、7、10为癌旁组织基因表达量显著高于肿瘤组织,而N0.4和N0.8则是肿瘤组织基因表达量显著高于癌旁,其余两例无显著性差异。四、结论SULT1A1在HCC样本中,其代谢活性明显下降,其直接原因与蛋白表达量下降有关,这可能是由于HBV相关的原发性肝细胞癌导致肿瘤组织基因的改变,表现为转录的mRNA表达的下调,翻译得到的蛋白质也随之减少,从而导致了活性的降低。SULT1A3在HCC样本中,活性、蛋白表达量有明显升高的趋势,该现象与“肿瘤返祖”学说具有一致性。但与mRNA表达量趋势不同,推测SULT1 A3在肿瘤组织表达增高的机制,可能不是由于基因的改变,而是在翻译过程中产生了改变,导致SULT1A3亚型的蛋白表达在肿瘤组织中显著增高,从而导致活性的增高。