TCH 1-3 在拟南芥根系机械响应中的作用

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植物根系的形态建成及其功能直接影响植物的生长和发育。在植物根系生长的土壤环境中,以岩石阻碍、土壤贯入阻力、重力、接触刺激等为代表的机械刺激一直是植物学家们关注的非生物胁迫因子。因此,植物根系对土壤环境中机械刺激的正确应答是植物得以生存和发展的前提和基础。研究表明,拟南芥中受机械接触(Touch)诱导表达的TCH1-4基因参与了拟南芥机械响应的过程,其中TCH1-3基因编码的钙调蛋白(Calmodulin, CaM)和钙调蛋白类似蛋白(CaM-like protein, CML)在机械响应的钙信号途径中有着重要作用。然而TCH1-3基因在拟南芥根系机械响应中的功能仍不清楚。因此,本文基于反向遗传学的研究思路和方法,利用突变信息明确的tch1(cam2-1、cam2-3)、tch2(cml24-2、cml24-4)、tch3(cml12-2)突变型和野生型拟南芥为实验材料,在倾斜的琼脂表面和不同硬度琼脂层培养基中进行试验,通过比较和分析拟南芥在主根长度、根系生长表型、侧根发育、主根穿透率等方面的差异性和规律性,来探索TCH1-3在拟南芥根系响应接触机械刺激和主根穿透中的潜在功能。本文首先将野生型拟南芥培养在与重力方向呈0、15、30、45和60的倾斜琼脂表面上,根据不同倾斜角度培养下,拟南芥主根生长长度、主根生长方向、侧根发育情况等,筛选出最佳的倾斜培养角度,建立了一个拟南芥根系接触机械刺激加载方式。实验结果表明,不同倾斜角度造成的不同强度的接触机械刺激能够调控拟南芥根系的生长发育,并且比较各倾斜角度培养下拟南芥根系的生长表型发现,在30的倾斜角度下,拟南芥主根伸长量适宜,主根生长方向未出现明显偏斜,并且侧根密度较大,因此,确定30的倾斜角度为后续实验的接触刺激加载方式。根据已建立的接触刺激加载方式,通过比较和分析tch1-3突变型和野生型拟南芥根系的机械响应行为,发现持续的接触机械刺激导致了tch2(cml24-2、cml24-4)和tch3(cml12-2)突变体在主根伸长生长、侧根发育方面出现缺陷,并且cml24-2和cml24-4突变体主根在琼脂表面分别出现了明显的向左和向右偏斜。上述结果表明,TCH2和TCH3基因的正常功能为拟南芥根系机械响应所必需,其编码的CML24-2、CML24-4、CML12-2在维持拟南芥主根和侧根的正常生长发育方面具有重要作用。对植物根系向重性的研究表明,根冠中淀粉粒的合成和分布情况影响着根尖的生长方向和根系的生长表型。因此,在接触机械刺激下,对tch1-3突变型拟南芥主根根冠细胞内淀粉粒的研究能够更好地理解拟南芥主根在倾斜琼脂表面的偏斜生长行为。实验结果发现,cml24-2和cml24-4突变体主根根冠中淀粉粒的合成较少,且淀粉粒在根冠细胞中的聚集程度较低。因此,推测CML24-2、CML24-4蛋白很可能影响了根冠中淀粉粒的合成,从而调控拟南芥主根的生长方向。拟南芥主根在不同硬度琼脂层培养基中的贯穿生长可以模拟其在土壤中克服土壤贯入阻力而继续生长的情况。为了探索TCH1-3基因在拟南芥主根穿透中的生理功能,我们利用不同浓度的琼脂层培养基模拟植物根系生长的土壤环境进行测试。首先,对琼脂培养基的弹性模量进行了测定,初步探索了培养基琼脂浓度与培养基弹性模量之间的线性关系。其次,通过对野生型拟南芥进行穿透测试,发现当上、下层培养基琼脂浓度分别为1.0%、0.5%(上层琼脂浓度为下层的2倍)时,野生型拟南芥主根的机械穿透率达到最大值(96%6.255%)。最后,在上述琼脂层浓度下,对比tch1-3突变体与野生型拟南芥主根的穿透率,发现tch2(cml24-2和cml24-4)的主根穿透率显著地小于野生型,这表明,tch2突变体主根在响应培养环境的机械性质上较野生型敏感,并且TCH2基因可能在拟南芥主根的穿透能力中具有重要的生理功能。
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