猪瘟是由猪瘟病毒引起的发热、急性、高度接触性传染病。该病死亡率高,不同年龄、性别和品种的猪均可发病,一年四季均可发生。目前,该病尚无十分有效的药物和治疗方法。采用品质优良的猪瘟疫苗进行预防接种,仍是当今猪瘟防控过程中行之有效的重要手段之一。于是,猪瘟疫苗质量优劣及其预防免疫效果,已成为决定猪瘟防疫成败的关键因素。从多年的免疫接种和市场应用效果来看,我国的HCLV株在安全性和有效性方面表现十分优异,已成为世界公认的猪瘟活疫苗标准毒株。一直以来,传统猪瘟疫苗以兔源组织苗(包括脾淋苗、乳兔苗)和原代细胞苗为主。其生产成本高、污染难以控制、动物需求量大、工艺过程难以监测等缺点,已成为猪瘟疫苗大规模生产中一时无法逾越的瓶颈难题。随着猪瘟ST传代细胞源活疫苗的成功开发与应用,这些技术难题便迎刃而解。由于传统转瓶细胞培养技术的长期普遍应用,疫苗批间差异大、质量稳定性差、抗原滴度低、免疫效果差、不良反应大等新的影响猪瘟疫苗质量的难题也随之而来。本课题采用自主研发的细胞培养微载体及其应用技术,结合细胞生物反应器大规模高密度悬浮培养ST细胞,制备稳定均一的CSFV抗原,从根本上解决传统工艺面临的各种难题。同时,通过反应器细胞培养技术条件优化,有效提高病毒滴度,稳定病毒生产过程,建立一套完善的猪瘟病毒抗原大规模生产技术工艺,为制造稳定高效的猪瘟疫苗奠定良好的技术基础。为此,本课题的研究内容主要包括以下五个部分:第一部分:ST细胞单层静置培养特性及CSFV转瓶培养工艺研究。通过对ST细胞株培养特性的研究,可以看出,该细胞株生长速度快,细胞状态好。细胞倍增时间(DT)为16.1 h,72 h转瓶ST细胞密度达7.6×10~5 cells/mL,具有较强的生长扩增能力。在细胞培养至48 h,按4%(v/v)接种量接种CSFV种子细胞毒。CSFV并不引起ST细胞产生特征性CPE。从细胞日糖耗量看,CSFV感染细胞糖耗水平略高于正常细胞。病毒收获从接毒后第5 d开始,共5收。除第1收外,各收次病毒滴度为5×10~5 RID/mL。结果表明,CSFV能在经人工选育的ST细胞株上正常增殖,为病毒的大规模培养准备了很好的前提条件。第二部分:微载体细胞培养性能研究与微载体选择。本研究分别从细胞上球率、贴壁时间、最大细胞生长密度等多项指标上考察了Cephodex和CephodexD两款细胞微载体的生物相容性和对ST细胞的适应性。从细胞上球阶段培养效果来看,ST细胞在CephodexD微载体上的上球时间为2 h,上球率为92.7%,细胞在载体表面能在较短时间内表现出良好的铺展性。而ST细胞在Cephodex载体上的上球时间为6 h,上球率为62.3%,且细胞在载体表面的延展性较差。从最大细胞生长密度来看,ST细胞在CephodexD上72 h细胞密度为1.9×10~6cells/mL,而在Cephodex上为1.3×10~6cells/mL,两者相差约50%。在不更换培养液的条件下,ST细胞能在CephodexD微载体上维持存活7 d以上,而在Cephodex微载体上则存活不足5 d。一系列研究表明,CephodexD微载体在生物相容性、ST细胞适应能力等方面明显优于Cephodex载体,而且更能满足CSFV大规模培养的技术工艺要求。第三部分:CSFV微载体摇瓶培养及其放大工艺研究。本研究采用摇瓶培养法进行新型微载体细胞培养技术工艺研究,主要从载体用法用量、细胞接种与微载体悬浮培养步骤方法以及糖耗测定与病毒效价测定等各个方面做了详细的条件探索。初步确定了4 g/L的微载体用量、细胞培养48 h的CSFV接种时间以及1:5的工艺放大比率。通过中间过程补料技术,可以达到1.86×10~6 cells/mL的最大细胞培养密度。选择ST细胞培养48 h进行病毒接种,可以使CSFV滴度达到7.5×10~5RID/mL,较转瓶工艺略有提升。按1:5的比率进行放大培养,既降低了种子制备的工作压力,又兼顾了操作过程的可行性,同时也保证了放大培养的终端规模。第四部分:CSFV微载体反应器悬浮培养及其放大工艺建立。本部分研究了采用细胞生物反应器和新型细胞微载体CephodexD进行ST细胞的大规模悬浮培养,并以此为基础建立了一套完善的CSFV大规模生产技术工艺。参考摇瓶培养法的技术数据,完成了微载体悬浮培养从3 L到15 L反应器级联放大工艺过程。采用胰酶二步消化法,实现了细胞与微载体的完全分离以及细胞之间的相互分散。反应器内ST细胞生长72 h,最大细胞密度可达2.93×10~6 cells/mL。ST细胞培养48 h后,按4%(v/v)接种CSFV种子细胞毒。从接毒后第4 d开始收毒,之后每3 d收获一次,共5收。病毒滴度为1×10~6 RID/mL,是转瓶工艺的2倍。整个收毒过程维持16 d,较转瓶工艺缩短5 d。研究表明,猪瘟病毒的新型微载体反应器悬浮培养技术较传统转瓶培养工艺,不仅大大提高了生产效率,而且很好地提高了病毒抗原的质量水平。这也为今后高质量猪瘟ST传代细胞源活疫苗的工业化生产奠定了良好的技术基础。第五部分:免疫原性及免疫效果评价。本部分将新型微载体反应器工艺生产的CSFV接种试验猪,14 d后采血。ELISA试验测出试验猪血清中含有较高水平的CSFV抗体。采用IFA法,研究了反应器培养的CSFV的抗原特异性。在荧光显微镜下,可见感染CSFV的ST细胞胞浆内有明显的颗粒状或弥散性荧光,且荧光反应主要集中于细胞浆中,而未感染的ST细胞则无荧光。这些研究表明,反应器培养的CSFV具有良好的免疫原性和反应原性。同时,将新工艺制备的CSFV接种试验组猪和对照组猪各5只。14 d后,进行CSFV强毒攻毒试验。观察16 d,免疫猪无明显的临床症状,也无明显的发热反应,保护率达100%。对照组猪临床症状明显,有发热反应,全部死亡。结果表明,新型微载体悬浮培养技术制备的CSFV抗原具有良好的免疫保护效果。