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研究目的:本研究通过建立卵清白蛋白诱发的大鼠哮喘模型,确证黄芩苷防治过敏性哮喘的药效作用,并探讨其可能的作用机制,为临床用黄芩苷防治过敏性哮喘提供临床前实验证据。研究方法:将55只SD大鼠随机分为5组,分别为对照组、模型组、地塞米松组、黄芩苷高剂量组、黄芩苷低剂量组,每组10~15只大鼠。通过卵清白蛋白(OVA)双次致敏后并连续激发14天建立大鼠过敏性哮喘模型。从首次致敏次日起,每组大鼠灌胃以相应的药物进行预防性给药,连续给药27天。末次激发后24 h内处理动物并进行相应取材,通过哮喘程度评分、哮喘潜伏期及肺组织病理学观察,黄芩苷平喘药效进行评价;通过支气管壁厚度、气道上皮下胶原沉积程度、支气管平滑肌厚度、TGF-β1蛋白、p-ERK1/2蛋白、ERK1/2mRNA水平的检测,探究黄芩苷抑制气道重塑的作用与机制;通过支气管炎症变化的观察与HMGB-1、HMGB-1 mRNA、TLR4蛋白、TLR4 mRNA、p-p38蛋白水平的检测,探究黄芩苷抗炎机制。研究结果:1、过敏性哮喘模型建立雾化过程中除对照组外,其余各组大鼠均出现呼吸急促、呛咳、节律性收腹样喘促、行动迟滞和反应迟钝等症状,满足建模标准,表明过敏性哮喘模型建立成功。相应的,哮喘程度量化结果也显示,对照组动物只有0分表现,而模型组动物数量多集中于3、4分;末次激发诱导大鼠腹肌痉挛时,测得模型组的潜伏期(75.33±15.17)明显较对照组(360s内未出现腹肌痉挛)短。以上结果均表明已成功建立过敏性哮喘模型。2、黄芩苷防治过敏性哮喘的药效学评价1)哮喘程度评分结果显示,黄芩苷高剂量(S3=0、S4=0)、低剂量(S3=1、S4=0)给药组的3、4分的动物数量均比模型组(S3=10、S4=3)明显减少(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.01);2)潜伏期测定结果显示,与模型组(75.33±15.17)比较,黄芩苷高剂量(194.00±31.70)、低剂量组(199.88±60.69)大鼠哮喘潜伏期均有明显延长(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05);3)肺组织HE染色结果显示,模型组大鼠的肺组织病理损伤严重,肺泡结构异常,支气管与小血管周围出现大量炎性细胞浸润,支气管粘膜水肿且内部有大量炎症渗出物及分泌液。黄芩苷高、低剂量给药组相对于模型组,肺泡结构、炎性细胞浸润情况、支气管粘膜水肿、气道上皮增生程度都有所改善,但组间未见明显差异。3、黄芩苷对哮喘大鼠气道重塑的抑制作用1)通过HE染色检测支气管壁厚度,结果显示,与模型组(82.07±1.59)比较,黄芩苷高剂量(65.95±1.81)、低剂量组(68.99±1.34)均可有效降低支气管管壁增厚(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05),但未见明显的剂量依赖性;2)使用Masson染色法检测支气管上皮下胶原沉积程度,结果显示,与模型组(77.69±3.59)比较,黄芩苷高剂量(56.55±3.13)低剂量组(58.36±2.93)均可改善哮喘大鼠支气管上皮下胶原沉积(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05);3)使用免疫组化法检测肺组织α-SMA表达情况,评估支气管壁厚度,结果显示,与模型组(48.85±1.93)比较,黄芩苷高剂量(15.93±0.81)、低剂量组(18.47±1.55)和均可改善缓解大鼠气道平滑肌增生(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.01),未见明显的剂量依赖性;4)使用免疫组化法检测气道组织TGF-β1蛋白表达情况,结果显示,与模型组(0.62±0.05)比较,黄芩苷高剂量(0.41±0.03)低剂量组(0.46±0.02)均可降低哮喘大鼠气道组织TGF-β1蛋白表达水平(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05),且呈一定的剂量依赖性增强;5)使用免疫组化法检测肺组织p-ERK1/2蛋白表达情况,结果显示,与模型组(0.714±0.086)比较,黄芩苷高剂量(0.447±0.02)、低给药组(0.447±0.02)的p-ERK1/2蛋白表达水平明显下降(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05);6)使用Real-time PCR法检测ERK1/2 mRNA表达水平,结果显示,与模型组(321.35±17.15)比较,黄芩苷高剂量(49.73±6.39)、低剂量组(26.35±5.68)均可明显抑制哮喘大鼠肺组织ERK1/2 mRNA表达(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.01)。4、黄芩苷对哮喘大鼠肺及气道炎症的抑制作用1)支气管HE染色结果显示,模型组支气管炎症变化明显:支气管变形,粘膜水肿,管径狭窄,杯状细胞和上皮细胞严重增殖,管周存在大量炎性细胞浸润和堆积,管腔内存在大量炎症渗出物;黄芩苷高、低剂量给药组支气管结构较为完整,但也有一定的变形,粘膜层也有杯状细胞和上皮细胞增殖情况,管周有一定的炎性细胞浸润现象,但程度较模型组轻;2)使用ELISA法检测血浆HMGB1含量,结果显示,与模型组(772.66±46.01)比较,黄芩苷高剂量(278.99±40.70)、低剂量(294.30±32.47)给药均可明显降低血浆HMGB1含量(黄芩苷高、低剂量组,p<0.05),未见明显剂量依赖性;3)使用Real-time PCR法检测肺组织HMGB1 mRNA含量,结果显示,黄芩苷高、低剂量组HMGB1 mRNA含量较模型组均有一定下降趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05);4)使用免疫组化法检测气道组织TLR-4蛋白表达情况,结果显示,与模型组(0.596±0.053)比较,黄芩苷高剂量(0.352±0.066)、低剂量(0.451±0.061)给药组均可明显降低气道组织TLR-4蛋白表达水平(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.05);5)使用Real-time PCR法检测气道组织TLR-4 mRNA水平,结果显示,与模型组(91.78±11.18)比较,黄芩苷高剂量剂量(6.43±0.20)、低剂量(27.17±0.86)给药均可明显降低气道组织TLR-4 mRNA水平(黄芩苷高、低剂量组VS模型组,p<0.01),且降低趋势与气道组织TLR-4蛋白表达相吻合;6)使用免疫组化和Western blotting法检测p-p38的表达情况,免疫组化结果显示,与模型组(0.781±0.108)比较,黄芩苷高剂量(0.673±0.004)剂量组的p-p38水平可见显著降低(黄芩苷高剂量组VS模型组,p<0.05);Western blotting结果显示,与模型组(2.701±0.202)比较,黄芩苷高剂量(1.431±0.204)、低剂量(1.209±0.127)给药均可明显降低肺组织p-p38蛋白水平(黄芩苷高剂量组VS模型组,p<0.05);结论:在本实验研究条件下,黄芩苷分别高剂量(0.32 g/kg)、低剂量(0.08 g/kg)连续给药27天,对OVA诱发的大鼠过敏性哮喘具有明显的防治作用;黄芩苷抑制哮喘气道重塑是其有效防治哮喘发作的重要机制,且此抑制作用与黄芩苷抗炎作用密切相关。