论文部分内容阅读
肌苷酸(IMP，inosine monophosphate acid)是畜禽肉中重要的风味物质，目前国际上把IMP含量作为衡量肉质鲜味的一项重要指标。在动物体内，IMP从头合成共涉及十步反应，其中腺苷琥珀酸裂解酶(ADSL，adenylosucclnate lyase)是催化第八步反应的酶，也是合成IMP过程中的关键酶之一。PurH(ATIC)是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶(AICARTfase)(EC 2.1.2.3)和次黄嘌呤核苷酸环水解酶(IMPCH)(EC3.5.4.10)催化活性的双功能酶，催化肌苷酸(IMP)合成的最后两步反应一第九步与第十步，对IMP的合成具有关键的调控作用。
克隆连城白鸭、金陵白鸭以及樱桃谷鸭ADSL和PurH基因的完整编码区(CDS)，进行核酸和蛋白序列分析，研究这两个基因在各品种肌肉组织mRNAs表达水平；分别对三个品种鸭肌肉组织这两个基因mRNAs表达水平与肌肉组织肌苷酸(IMP,inosine monophosphate acid)含量进行相关性分析。为揭示我国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定了理论基础。
1ADSL和PurH基因的克隆测序
通过对多个物种ADSL和PurH基因进行同源性比对，寻找高度保守区并在该区域设计先设计一对引物，然后根据已扩片段再设计两对引物扩增两端序列，借助RT-PCR和染色体步移技术获得三个品种鸭ADSL和PurH基因部分cDNA序列，它们包含了完整的编码区，CDS长度分别为1380bp和1782bp。
2ADSL和PurH蛋白的生物信息学分析
运用生物信息学方法分析三个品种鸭ADSL和PurH基因编码区序列、蛋白结构和进化关系。预测出ADSL和PurH分别编码459和593个氨基酸残基。ADSL理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白，有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构，蛋白二级结构主要由α螺旋构成，另外含有少量β折叠、β转角及无规则卷曲结构。该蛋白含有腺苷酸基琥珀酸裂解酶蛋白家族的典型结构域PRK08937、且和鸡的蛋白结构域一致。PurH也为一偏碱性蛋白，有不太明显的信号肽，但含有跨膜结构，蛋白二级结构主要由α螺旋与β折叠构成，另外还包含一些卷曲结构和β转角结构。PurH和其它物种该酶一样含有PurH蛋白家族的MGS-Iikesuperfamily，AICARFT-IMPCHassuperfamily典型结构域。同源性分析发现，鸭与鸡的亲缘关系最近，ADSL与其它物种同源性都在75%以上，ATIC与其它物种的同源性也都在79%以上，表明这两个基因在动物的发育进化中是比较保守的。
3Real-timePCR分析ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达
采用RT-PCR技术，分析了三个品种鸭ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达水平，结果表明：ADSL和PurH基因在三个品种鸭的胸肌和腿肌中均表达，连城白鸭、金陵白鸭及樱桃谷鸭之间的表达量差异极显著(P＜0.01)；这三个品种中，雌性表达量要极显著高于雄性(P＜0.01)。各个体胸肌ADSL基因表达量要显著高于腿肌(P＜0.05)，樱桃谷鸭除外(P＞0.05)；连城白鸭各个体胸肌PurH基因表达量要显著高于腿肌(P＜0.05)，而金陵白鸭和樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量差异不显著(P＞0.05)。
4鸭肌肉组织肌苷酸含量的测定
采用高效液相色谱法测定了三个品种鸭胸肌和腿肌中rMP的含量，结果表明：不同品种之间IMP含量差异极显著(P＜0.01)，以连城白鸭最高、金陵白鸭次之、樱桃谷鸭最低；同一品种内雌性显著高于雄性(P＜0.05)；各个体胸肌显著高于腿肌(P＜0.05)。
5鸭肌肉组织ADS和PurH基因mRNA表达量与对应组织肌苷酸含量的相关性分析
通过对ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织IMP含量相关性分析，结果表明：ADSL和PurH基因表达量和对应组织IMP含量有着较高的正相关性。不同品种、不同性别及不同组织(樱桃谷鸭除外)ADSL基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9592，0.9618，0.9577;不同品种、不同性别PurH基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9609，0.9584，连城白鸭胸肌和腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量的相关系数R2为0.8156，金陵白鸭与樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量无明显相关性。
克隆连城白鸭、金陵白鸭以及樱桃谷鸭ADSL和PurH基因的完整编码区(CDS)，进行核酸和蛋白序列分析，研究这两个基因在各品种肌肉组织mRNAs表达水平；分别对三个品种鸭肌肉组织这两个基因mRNAs表达水平与肌肉组织肌苷酸(IMP,inosine monophosphate acid)含量进行相关性分析。为揭示我国优良地方鸭种的风味基因结构、研究其生物学功能以及与重要风味物质的关系奠定了理论基础。
1ADSL和PurH基因的克隆测序
通过对多个物种ADSL和PurH基因进行同源性比对，寻找高度保守区并在该区域设计先设计一对引物，然后根据已扩片段再设计两对引物扩增两端序列，借助RT-PCR和染色体步移技术获得三个品种鸭ADSL和PurH基因部分cDNA序列，它们包含了完整的编码区，CDS长度分别为1380bp和1782bp。
2ADSL和PurH蛋白的生物信息学分析
运用生物信息学方法分析三个品种鸭ADSL和PurH基因编码区序列、蛋白结构和进化关系。预测出ADSL和PurH分别编码459和593个氨基酸残基。ADSL理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白，有较为强烈的信号肽和细胞内跨膜结构，蛋白二级结构主要由α螺旋构成，另外含有少量β折叠、β转角及无规则卷曲结构。该蛋白含有腺苷酸基琥珀酸裂解酶蛋白家族的典型结构域PRK08937、且和鸡的蛋白结构域一致。PurH也为一偏碱性蛋白，有不太明显的信号肽，但含有跨膜结构，蛋白二级结构主要由α螺旋与β折叠构成，另外还包含一些卷曲结构和β转角结构。PurH和其它物种该酶一样含有PurH蛋白家族的MGS-Iikesuperfamily，AICARFT-IMPCHassuperfamily典型结构域。同源性分析发现，鸭与鸡的亲缘关系最近，ADSL与其它物种同源性都在75%以上，ATIC与其它物种的同源性也都在79%以上，表明这两个基因在动物的发育进化中是比较保守的。
3Real-timePCR分析ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达
采用RT-PCR技术，分析了三个品种鸭ADSL和PurH基因在肌肉组织中的相对表达水平，结果表明：ADSL和PurH基因在三个品种鸭的胸肌和腿肌中均表达，连城白鸭、金陵白鸭及樱桃谷鸭之间的表达量差异极显著(P＜0.01)；这三个品种中，雌性表达量要极显著高于雄性(P＜0.01)。各个体胸肌ADSL基因表达量要显著高于腿肌(P＜0.05)，樱桃谷鸭除外(P＞0.05)；连城白鸭各个体胸肌PurH基因表达量要显著高于腿肌(P＜0.05)，而金陵白鸭和樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量差异不显著(P＞0.05)。
4鸭肌肉组织肌苷酸含量的测定
采用高效液相色谱法测定了三个品种鸭胸肌和腿肌中rMP的含量，结果表明：不同品种之间IMP含量差异极显著(P＜0.01)，以连城白鸭最高、金陵白鸭次之、樱桃谷鸭最低；同一品种内雌性显著高于雄性(P＜0.05)；各个体胸肌显著高于腿肌(P＜0.05)。
5鸭肌肉组织ADS和PurH基因mRNA表达量与对应组织肌苷酸含量的相关性分析
通过对ADSL和PurH基因mRNA表达量与对应组织IMP含量相关性分析，结果表明：ADSL和PurH基因表达量和对应组织IMP含量有着较高的正相关性。不同品种、不同性别及不同组织(樱桃谷鸭除外)ADSL基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9592，0.9618，0.9577;不同品种、不同性别PurH基因表达量与对应组织肌苷酸含量的相关系数R2分别为0.9609，0.9584，连城白鸭胸肌和腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量的相关系数R2为0.8156，金陵白鸭与樱桃谷鸭各个体胸肌与腿肌PurH基因表达量与对应肌苷酸含量无明显相关性。