大量的动物实验和临床数据表明,反复癫痫发作会导致海马神经元损伤甚至死亡。海马神经元的损伤会诱发苔藓纤维芽生、抑制性神经元丢失等,从而形成新的异常神经网络导致癫痫再发作,并进一步损伤海马神经元。海马神经元损伤不仅是癫痫发作的结果,更重要的是,它促进了癫痫的发生和进展。因此,修复癫痫发作后神经元损伤是癫痫治疗中亟待解决的问题。本研究旨在通过体外PC12细胞的氧化应激损伤模型和体内PTZ点燃癫痫大鼠模型的实验研究,验证旋转恒定磁场对癫痫发作诱导的神经元损伤是否具有保护作用,并探讨其神经元保护机制是否与AMPK-PINK1-Parkin信号通路相关,为癫痫患者癫痫发作后神经元损伤提供一种无创的物理治疗方法。实验一:旋转恒定磁场抑制PC12细胞的氧化应激损伤的研究目的:本研究拟应用H2O2制备PC12细胞氧化应激损伤模型,观察旋转恒定磁场抗氧化应激损伤的效果。方法:使用不同浓度H2O2体外处理PC12细胞24小时后,选取半抑制浓度（IC50）构建PC12细胞氧化应激损伤模型。选取不同磁场强度和作用时长的旋转恒定磁场进行干预,CCK8法检测PC12细胞活性,以选取最佳磁场刺激参数。采用Western blot检测凋亡相关蛋白、流式细胞术检测ROS水平,Elisa检测氧化应激相关参数和线粒体呼吸链复合酶活力以及使用JC-1通过免疫荧光检测线粒体膜电位水平。结果:1.随着H2O2浓度增高,PC12细胞死亡增加,存活减少,IC50浓度约为300μmol/l,使用该浓度构建PC12细胞氧化应激损伤模型。2.对比不同参数组合旋转恒定磁场干预对PC12细胞存活率的影响,筛选出最佳旋转恒定磁场刺激参数4Hz,0.2 T,2h/d。3.Western blot结果显示,与sham组比较,H2O2组PC12细胞内Cleaved-caspase3蛋白表达水平明显升高、Bcl2蛋白表达水平降低;与H2O2组比较,给予旋转恒定磁场干预后,Cleaved-caspase3蛋白表达水平降低、Bcl2蛋白表达水平升高。4.用DCFH-DA检测PC12细胞内ROS的聚集,结果显示H2O2组,荧光强度明显增高,PC12细胞中ROS生成增多。使用旋转恒定磁场干预后能够一定程度降低H2O2诱导的PC12细胞内ROS的产生。同时,与sham组相比,H2O2组PC12细胞中MDA和GSSG水平显著升高,SOD活性和GSH含量显著降低。与H2O2组比较,旋转恒定磁场干预后显著降低了H2O2诱导的PC12细胞中MDA和GSSG含量以及提高了SOD和GSH水平。5.JC-1免疫荧光结果显示与sham组相比,H2O2组PC12细胞线粒体膜电位水平明显下降,H2O2+RMF组PC12细胞线粒体膜电位水平较H2O2组升高。线粒体呼吸链复合酶活力的比较结果显示,与sham组相比,H2O2组PC12细胞线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV的活力下降,RMF干预后H2O2+RMF组PC12细胞线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV的活力较H2O2组升高。结论:1.旋转恒定磁场具有神经元保护作用。2.旋转恒定磁场对神经元的保护作用可能是通过抗凋亡、抗氧化应激、保护线粒体功能来实现的。实验二:旋转恒定磁场修复癫痫大鼠海马神经元损伤的机制研究目的:研究旋转恒定磁场对PTZ点燃癫痫大鼠的保护作用及其对线粒体自噬和AMPK通路的影响,探究旋转恒定磁场修复癫痫大鼠海马神经元损伤的分子机制。方法:对亚惊厥剂量PTZ多次腹腔注射建立点燃癫痫大鼠模型,每天使用旋转恒定磁场干预。观察大鼠行为学特征及病理学变化。采用Western blot检测凋亡、线粒体自噬相关蛋白以及AMPK、p AMPK蛋白表达水平、免疫荧光检测神经元与Cleaved-caspase3、LC3B的共定位以及Tomm20与Lamp2、Parkin的共定位、流式细胞术检测线粒体膜电位水平、Elisa检测氧化应激参数以及线粒体呼吸链复合酶参数。结果:1.直至末次腹腔注射PTZ后,PTZ组大鼠完全点燃率为80%,PTZ+RMF组大鼠完全点燃率为53.33%,与PTZ组相比,RMF干预可降低大鼠痫性发作等级,显著延长了完全点燃潜伏期以及末次发作等级≥4级的发作潜伏期,缩短了癫痫发作的持续时间。2.水迷宫实验结果表明,与PTZ组相比,PTZ+RMF组大鼠的逃避潜伏期明显缩短。在空间探索实验中,与PTZ组相比,PTZ+RMF组大鼠在目标象限停留时间和穿越虚拟平台次数明显增加。3.透射电子显微镜及Nissl染色观察海马各区神经元结构显示,RMF干预后神经元损伤减轻,神经元存活数量明显增加。4.免疫荧光染色与Western blot结果一致,结果表明,与sham组比较,PTZ组海马各区神经元中Cleaved-caspase3蛋白表达明显增加,RMF干预后,Cleaved-caspase3蛋白表达减少。5.各组大鼠海马氧化应激参数检测结果显示,PTZ组中总SOD活力、CAT活力以及GPx的活力较sham组降低,而PTZ+RMF组较PTZ组升高。与sham组相比,PTZ组大鼠海马中MDA含量、GSSG含量明显升高,GSH的含量明显降低。与PTZ组相比,PTZ+RMF组MDA含量、GSSG含量明显降低,GSH含量升高。6.透射电子显微镜观察海马线粒体超微结构发现PTZ+RMF组线粒体比PTZ组损伤减轻。线粒体膜电位结果显示PTZ+RMF组大鼠海马组织线粒体膜电位水平较PTZ组升高。另外,线粒体呼吸链复合酶活力检测结果表明,PTZ+RMF组大鼠海马组织线粒体呼吸链复合酶I、II的活力较PTZ组升高。7.免疫荧光染色共定位结果显示,与PTZ组比较,PTZ+RMF组海马神经元中LC3B表达增加,Tomm20与Lamp2共定位增加以及Tomm20和Parkin共定位增加。Western blot结果显示,与PTZ组比较,PTZ+RMF组大鼠海马中LC3B、PINK1、Parkin蛋白表达水平升高。8.与PTZ组比较,PTZ+RMF组大鼠海马中p AMPK/AMPK比值增加。结论:1.旋转恒定磁场干预能够降低PTZ致痫大鼠的癫痫易感性,改善PTZ致痫大鼠的认知功能。2.旋转恒定磁场干预对PTZ致痫大鼠,具有抗凋亡、抗氧化应激以及保护线粒体结构和功能的作用。3.旋转恒定磁场干预能够促进癫痫大鼠海马神经元PINK1-Parkin介导的线粒体自噬以及激活AMPK信号通路。实验三:旋转恒定磁场通过调控AMPK-PINK1-Parkin修复PC12细胞氧化应激损伤的机制研究目的:探讨旋转恒定磁场对PC12细胞氧化损伤保护作用的分子机制是否与AMPK-PINK1-Parkin相关。方法:制备H2O2诱导的PC12细胞氧化应激损伤模型,给予旋转恒定磁场干预,并使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和AMPK抑制剂Compound C对PC12细胞进行预处理,采用CCK8检测细胞活力,Western blot检测凋亡相关蛋白、QPCR检测线粒体自噬相关m RNA的表达以及流式细胞术检测凋亡、ROS水平。结果:1.线粒体红色探针与自噬体标志物LC3B荧光共定位结果显示,与H2O2组比较,给予RMF干预后,PC12细胞内线粒体与LC3B共定位增加。Western blot实验检测线粒体自噬相关蛋白,结果显示,与H2O2组比较,RMF干预后,PC12细胞内LC3B、PINK1、Parkin蛋白表达水平升高。2.与H2O2组比较,RMF干预后,p AMPK/AMPK比值增加。3.使用线粒体自噬抑制剂Mdivi-1对PC12细胞进行预处理后结果显示,与H2O2组相比,添加Mdivi-1加剧了PC12细胞的死亡,与H2O2+RMF组相比,添加Mdivi-1部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞活力的提高。同时,Western blot结果显示,与H2O2组相比,添加Mdivi-1后加剧了PC12细胞内Cleaved caspase-3表达的增加以及Bcl2表达的减少,与H2O2+RMF组相比,添加Mdivi-1部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞的抗凋亡作用。4.使用AMPK抑制剂Compound C对PC12细胞进行预处理后结果显示,与H2O2组相比,添加Compound C降低了PC12细胞中LC3B/LC3A m RNA比值以及PINK1 m RNA、Parkin m RNA的表达。与H2O2+RMF组相比,添加Compound C部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞线粒体自噬相关m RNA表达的增加。同时,流式细胞术结果显示,与H2O2组相比,添加Compound C后加剧了PC12细胞内凋亡和ROS水平的升高,与H2O2+RMF组相比,添加Compound C部分逆转了旋转恒定磁场对H2O2诱导的PC12细胞抗凋亡、抗氧化作用。结论:1.旋转恒定磁场干预后促进H2O2诱导的神经元PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,激活AMPK信号通路。2.旋转恒定磁场对神经元的保护作用可能部分依赖于AMPK-PINK1-Parkin的调控。