背景:近年来,慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患病率呈现不断增高趋势。因其发病隐匿,中后期疾病进展迅速且预后差,公众对该病知晓率不足等因素,已成为全球关注的重要公众健康问题。既往研究显示,CKD的早期筛查和干预,可以有效缓解病情进展,改善预后。研究不同地区和人群CKD发病情况与影响因素,有助于阐明其流行规律及发生发展机制,对制定合理有效的CKD防治方案,降低发病率,减轻疾病负担,提高患者生活质量有十分重要的意义。本研究以河南成年人为研究对象,通过现场调查、临床实验室检测及尿液细胞外囊泡（urinary extracellular vesicle,简称uEV）转录组学分析,对CKD流行特征、影响因素、发生机制等进行探讨。一方面,为全面了解该地区CKD流行情况和疾病负担提供数据支撑;另一方面,对发生CKD的风险因素进行评估,为该病防治策略制定及早期干预提供科学依据。方法在河南许昌、驻马店、洛阳和郑州4个地区,对农村和城市18岁以上居民分别进行抽样调查。调查内容包括问卷调查、体格检查、血液和尿液标本收集检测。CKD判断:采用估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,简称eGFR）结合尿点式白蛋白（Urinary albumin-to-creatinineratio,简称UACR）方法,受访者出现eGFR＜60 mL/min/1.73m2和/或白蛋白尿（UACR＞30mg/g）三个月,确定为CKD。将CKD受访者进一步分为三个组别:eGFR下降组,白蛋白尿组,糖尿病伴CKD（Diabetic kidney disease,简称DKD）组。患病率的标化采用2010年全国第六次人口普查数据。率的比较采用卡方检验,连续变量比较采用t检验。多元二分类Logistic回归分析,多分类有序Logistic 回归分析,人群归因危险度（Population attributable risk,简称 PAR）,限制性立方样条分析等均采用R统计软件进行。孟德尔随机化（Mendelian randomization,简称MR）分析:应用双样本MR研究设计,工具变量使用SNP基因位点,基因数据来自欧洲数据银行基因库和慢性肾脏病基因组学数据库。暴露因子选择依据工具变量和前述研究的CKD风险因子确定,结局变量为eGFR和UACR。MR效应计算采用逆方差加权模型和沃德比值模型,组间异质性使用Q检验,基因多效性采用MR-Egger回归分析方法。尿液细胞外囊泡转录组学分析:研究对象来自郑州大学第一附属医院肾病内科住院并行肾穿刺活检确诊的糖尿病肾病（Type 2 diabetic nephropathy,简称T2DN）患者（病例组）和同时段该医院体检科健康志愿者（对照组）,收集研究对象晨尿标本,进行尿液细胞外囊泡提取和转录组学分析。uEV提取应用超速离心法,鉴定使用透射电子显微镜观察形态,纳米粒子跟踪分析仪测量直径,纳米流式分析仪检测表面标志蛋白的表达。经提取和纯化后,对总RNA进行标记、扩增和差异分析。对差异表达RNA进行Gene Ontology富集分析,利用STRING构建源自编码蛋白质的差异表达基因蛋白互作网络。应用ENCORI数据库预测miRNA-lncRNA、miRNA-mRNA的靶向调控关系。使用Pearson相关分析识别lncRNA-mRNA和circRNA-mRNA共表达关系。对预测的ceRNA网络中mRNA进行KEGG富集分析。结果第一部分农村居民慢性肾脏病流行特征与影响因素研究共纳入农村居民23869人,平均年龄56.43±13.12岁,男女比例1:1.49。受访者中,CKD 4347人,患病率18.2%;CKD患者中:eGFR下降635人,患病率2.7%;白蛋白尿3491人,患病率16.5%;DKD 962人,患病率4.0%。以性别和年龄分层:男性CKD 1670人,患病率17.4%;女性CKD 2680人,患病率18.8%,女性高于男性。60岁以下（18-39,40-59）两年龄组男性CKD患病率分别为15.7%和16.4%,女性分别为13.9%和15.1%,男性高于女性;60岁及以上（60-69,70-）两年龄组男性CKD患病率分别为15.8%和23.7%,女性分别为20.1%和32.0%,女性高于男性。eGFR下降组、白蛋白尿组以及DKD组患病率变化趋势与CKD一致,均显示为60岁以下男性患病率高于女性,而60岁及以上女性患病率高于男性。以不同受教育程度和家庭收入分层:受教育程度低、中、高组CKD患病率分别为21.0%、13.4%、15.1%,低受教育程度患病率最高;eGFR下降组和白蛋白尿组患病率变化趋势与此一致;DKD组患病率随受教育程度增高而下降,分别为4.5%、2.3%、1.5%。同样,家庭收入低、中、高组CKD患病率分别为17.0%、13.8%、16.8%,,低家庭收入家庭最高;eGFR下降组和白蛋白尿组患病率变化趋势与此一致;而DKD组患病率随着家庭收入增高而下降,分别为3.1%、2.6%、2.5%。以罹患不同慢性疾病分析:罹患糖尿病的受访者CKD患病率最高,为35.5%,OR=2.89;其次为高尿酸血症30.4%、高血压19.2%、脂代谢异常21.2%。同时罹患多种疾病者中,高血压+糖尿病+高尿酸血症组CKD患病率最高,达50%,OR=4.55;其次为糖尿病+高尿酸血症组48.7%、高血压+糖尿病+高血脂组45.0%。对血压、血糖、血尿酸和血脂进行变量分级分析显示,单一舒张压升高增加CKD和DKD发生的风险（OR=2.65＆2.64）高于单一收缩压升高（OR=2.22＆2.38）,其中舒张压每升高10 mmHg,发生CKD的OR值为2.22,收缩压每升高10 mmHg和20mmHg,发生CKD的OR值分别为1.40和1.73;空腹血糖每升高1 μmol/L,CKD发生风险增加25%;血尿酸每升高50μmol/L,男性CKD和DKD的发生风险增加39%和28%,女性CKD和DKD的发生风险增加58%和35%;在血脂指标中,血总胆固醇高,CKD和DKD发生风险最高,OR=1.66＆3.54。PAR结果显示,高血压、糖尿病和高脂血症对CKD和DKD发生风险的贡献度分别是:21.8%,11.2%,6.0%和31.6%,27.3%。限制性立方样条分析显示,收缩压、舒张压、血尿酸、血总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度的升高和CKD的发生呈J型曲线上升趋势,血高密度脂蛋白浓度升高和CKD发生风险呈负相关。血糖浓度与CKD发生风险呈弱U型曲线趋势。二分类Logistic回归分析显示,CKD的独立危险因素（依危险度大小排序）分别为:糖尿病、高血压、高尿酸血症、吸烟、低受教育程度、脂代谢异常、清淡饮食、BMI异常、高龄。有序Logistic回归分析显示,白蛋白尿进展的独立危险因素（依危险度大小排序）分别为:糖尿病、高血压、BMI异常、高尿酸血症、脂代谢异常、清淡饮食、重度体力活动;肾功能综合下降的独立危险因素分别为:糖尿病、高血压、高尿酸血症、脂代谢异常、重度体力活动、饮酒、清淡饮食、高龄。第二部分城市居民慢性肾脏病流行特征与影响因素共纳入5501人,平均年龄43.13±16.72岁,男女比例1:0.81。其中,男性CKD662人,患病率21.8%;女性CKD512人,患病率20.7%,男性高于女性。受访者中,CKD 1172人,患病率21.3%。其中eGFR下降142人,患病率19.8%;白蛋白尿1085人,患病率19.7%;DKD 232人,患病率4.2%。以年龄和性别分层发现,60岁以下两年龄组男性CKD患病率分别为7.4%和26.7%,均高于女性患病率（分别为3.4%和21.3%）;而60岁及以上两年龄组男性CKD患病率分别为29.1%和45.9%,均低于女性患病率（分别为36.6%和56.6%）。白蛋白尿以及DKD患病率变化趋势与CKD一致,均显示为60岁以下男性高于女性,而60岁以上男性低于女性;eGFR下降各年龄组组均为女性患病率高于男性。以不同受教育程度和家庭收入分层:受教育程度低、中、高组CKD患病率分别为33.5%、31.0%、17.9%,低受教育程度患病率最高,DKD和白蛋白尿组患病率变化趋势与此一致;eGFR组患病率随受教育程度变化呈U型,分别为2.3%、2.1%、3.2%。家庭收入低、中、高组CKD患病率分别为20.6%、20.0%、26.5%,,高家庭收入人群最高,白蛋白尿组患病率变化趋势与此一致;DKD组患病率随着家庭收入变化呈U型趋势,分别为5.5%、3.1%、5.5%。以罹患不同慢性疾病分析:罹患糖尿病的受访者CKD患病率最高,为50.4%,OR=4.99;其次为脂代谢异常41.2%、高血压33.4%、高尿酸血症26.4%。同时罹患多种疾病者中,高血压+糖尿病+脂代谢异常组CKD患病率最高,达71.8%,OR=12.55;其次为糖尿病+脂代谢异常组69.3%、糖尿病+脂代谢异常+高尿酸血症组61.9%。对血压、血糖、尿酸和血脂进行分级分析,舒张压升高增加CKD和DKD发生风险（OR=2.20＆3.19）高于收缩压升高（OR=1.71＆2.15）,其中舒张压每升高10 mmHg,发生CKD的OR值为1.71,收缩压每升高10 mmHg和20mmHg,发生CKD的OR值分别为1.35和1.66;。空腹血糖每升高1 μmol/L,CKD的发生风险即会增加49%。血尿酸每升高50 μmnol/L,CKD发生风险男女分别增加14%和47%,对DKD的发生风险无显著影响。血低密度脂蛋白高发生CKD的风险最高,OR=3.78,血甘油三酯高发生DKD的风险最高,OR=3.16。PAR结果显示,高血压、脂代谢异常和饮酒对CKD和DKD发生风险贡献度分别为:26.2%,13.4%,9.3%和35.9%,25.5%,9.4%。限制性立方样条结果显示,空腹血糖、收缩压、舒张压、血尿酸浓度升高和CKD的发生风险呈J型曲线上升趋势,血高密度脂蛋白浓度升高和CKD发生风险呈负相关。总胆固醇和低密度脂蛋白与CKD发生风险呈S型曲线上升趋势。二分类Logistic回归分析显示:CKD的独立危险因素（依危险度大小排序）为:高血压、糖尿病、脂代谢异常、肥胖、吸烟、超重、清淡饮食、高龄。有序Logistic回归分析显示:白蛋白尿进展的独立危险因素（依危险度大小排序）为:糖尿病、高血压、肥胖、脂代谢异常、重度体力活动、超重、吸烟、清淡饮食、高龄;肾功能综合下降的独立危险因素为:高血压、糖尿病、肥胖、脂代谢异常、吸烟、超重、高龄、清淡饮食。第三部分城乡居民慢性肾脏病流行特征比较与双样本孟德尔随机化分析共纳入城乡18岁以上居民29370人,平均年龄53.89岁,男女比1:1.33。人群CKD总患病率18.8%;其中:eGFR下降患病率2.8%,白蛋白尿患病率16.0%,DKD 患病率 3.9%。城乡居民人群特征比较,农村居民老龄化较重,受教育程度偏低,体力活动度更高。城市居民的吸烟和饮酒比例显著高于农村居民。CKD患病率城市居民（21.3%）高于农村居民（1 8.2%,P＜0.001）,而DKD患病率在城市居民（4.2%）和农村居民（4.0%）之间无显著差异。城乡居民CKD的共同风险因素包括:糖尿病、高血压、脂代谢异常、肥胖、吸烟、高龄。eGFR下降作为结局变量:MR计算结果显示,共243和106个SNP位点分别表明BMI升高和罹患高血压与发生eGFR下降呈现显著的正相关因果关系,MR-Egger回归分析显示结果均不存在水平多效性影响。MR estimate值分别为:BMI,β=0.15,se=0.05,P=5.50*10-3（OR=1.16,95%CI:1.05-1.29）;高血压,β=1.38,se=0.32,P=1.41*10-5（OR=3.97,95%CI:2.13-7.40）。UACR作为结局变量:MR计算结果显示,243和107个SNP位点分别表明BMI升高和罹患高血压与UACR升高呈现显著的正相关因果关系,检验结果显示基因间不存在多效性。MR estimate值分别为:BMI,β=0.08,se=0.02,P=1.56*10-4（OR=1.09,95%CI:1.04-1.13）;高血压,β=0.46,se=0.11,P=1.80*10-5（OR=1.58,95%CI:1.28-1.95）。第四部分糖尿病肾病患者尿液细胞外囊泡转录组学分析与发病机制探讨共纳入12名T2DN患者和12名健康对照,两组间年龄、性别、肝功能指标无显著差异。RNA表达差异分析结果显示,组间差异mRNA共1570个,差异 lncRNA 61 个,差异 circRNA 107 个,差异 miRNA 18 个。GO富集分析显示差异mRNA主要富集于糖分解代谢过程、线粒体呼吸链复合体、氧化还原酶活性、细胞黏附因子的调节等。蛋白质互作网络分析结果显示,差异mRNA主要作用于白细胞趋化、免疫受体活性、RNA剪接、snRNA结合和转录共激活因子的调控等。以差异表达miRNA为节点,共鉴定出312个lncRNA-miRNA-mRNA相互作用关系,332个circRNA-miRNA-mRNA相互作用关系,整合分析lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA互作关系后筛选出具有关键作用的两条miRNA:hsa-miRNA-22-3p 和 hsa-miRNA-92b-3p。对 ceRNA 网络中失调的 mRNA 进行 KEGG富集分析,发现其主要富集于溶酶体、细胞凋亡、p53信号通路、糖胺聚糖降解、造血细胞谱系、AGE-RAGE信号通路,在糖尿病及其并发症中的均发挥了重要作用。全文结论1、河南城乡成年居民CKD总患病率18.8%。其中农村居民患病率18.2%,城市居民患病率21.8%,城市高于农村。不同年龄、性别、受教育程度、家庭收入、体力活动等人群的CKD患病率不同。2、河南城乡成年居民CKD主要风险因素为糖尿病、高血压、脂代谢异常、高尿酸血症、吸烟、超重与肥胖、高龄、清淡饮食。3、BMI升高和罹患高血压与肾脏损伤之间存在因果关系。4、糖尿病肾病患者与健康对照之间uEV的转录组学结果差异显著,hsa-miRNA-22-3p和hsa-miRNA-92b-3p在竞争性内源RNA互作网络中具有重要作用,可作为糖尿病肾病的潜在生物标志物进一步研究。研究创新点1.本研究以河南城乡居民为研究对象,应用大样本横断面研究,全面阐述了该地区成年人慢性肾脏病的流行特征,为了解该地区的肾脏疾病负担以、高危人群及早期筛选与干预提供了有效的数据支撑。2.应用二分类结合多分类有序Logistic回归分析、人群归因危险度、限制性立方样条等多种方法,全面分析了慢性肾脏病的风险因素;同时基于分级、分类的整合分析,探讨了慢性肾脏病可干预风险因素及其贡献度,为制定肾脏疾病防治策略措施提供了科学依据。3.应用MR研究方法,确定了有关风险因素与肾脏疾病之间的因果关系。4.通过对尿液细胞外囊泡转录组学分析,发现了多个与糖尿病肾病发生有关的差异RNA,并对其作用机制进行了分析,为进一步阐明糖尿病肾病发病机制提供了新的知识,也为其无创诊断和疾病干预提供了新思路。