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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重微血管并发症之一,已成为发达国家和我国发达地区终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的主要原因,严重危害着人类的健康。DN主要病理改变是由于细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积,肾小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)增厚,进而导致系膜增殖和扩张,最终发展成为肾小球硬化和肾脏纤维化,丧失正常的肾脏功能。遗传和环境等多种因素都与DN的发生、发展密切相关,例如疾病家族史、长期高血压、持续性高血糖症和血脂异常等。目前,针对DN的临床治疗药物和生活方式改善等在疗效和安全性上不尽如人意。中药糖肾方(Tangshen Formula,TSF)是李平教授团队在继承名老中医经验基础上,结合自身临床实践和现代研究成果拟定的中药复方。在国家973和国际科技合作等项目资助下,课题组前期多中心临床试验证实糖肾方可以减少糖尿病肾病患者尿蛋白排泄率,改善肾小球滤过率。动物实验发现糖肾方显著减轻糖尿病大鼠肾脏病理损害,降低血中甘油三酯和胆固醇水平。提示糖肾方可能通过改善脂代谢紊乱,延缓DN肾脏进展。目的:1.利用自发性2型糖尿病肾病db/db小鼠观察糖肾方对于肾脏纤维化以及脂质沉积的影响。2.利用棕榈酸钠(PA)刺激mTECs细胞探讨相关作用机制。方法:八周龄雄性db/db小鼠随机分为2组(n=9),分别为模型组(db/db)、糖肾方组(db/db+TSF),八周龄雄性db/m小鼠(n=9)为正常对照组(db/m),所有小鼠均以常规普通饲料喂养。顺应性喂养2周后,开始给予糖肾方干预12周,禁食12 h后取血,全自动生化仪检测血脂及尿白蛋白等项目;处死小鼠,分离小鼠肾脏用于后续检测。利用PAS和Masson染色观察肾脏病理,油红O和Filipin染色观察肾脏脂肪变;利用肾脏组织胆固醇测定观察肾脏胆固醇沉积;利用Western Blotting、real-time PCR和免疫组化等技术检测肾脏组织纤维化TGF-β1/Smad3通路以及miRNA21和miRNA29b表达的影响,甘油三酯氧化过程中PPARα及胆固醇流出途径中PGC-1α、LXR和ABCA1表达的影响。应用PA刺激的mTECs细胞以及Abcal-siRNA,给予糖肾方干预后,检测细胞胆固醇含量以及胆固醇流出通路的变化,探讨糖肾方调节胆固醇流出的机制。结果:1.糖肾方可减轻db/db小鼠血脂紊乱及肾脏损伤:糖肾方可以显著减轻db/db小鼠体重,改善UACR;显著减轻血清中TG、TC、LDL-C等因子水平,但对HDL-C水平无显著改善。PAS及Masson染色发现db/db小鼠肾小球体积增大,系膜基质增生,肾小球系膜基质百分比显著升高,给予糖肾方干预后可显著改善上述现象。2.糖肾方改善db/db小鼠肾脏纤维化:Western Blotting、real-time PCR和免疫组化结果显示,糖肾方可下调db/db小鼠中TGF-β1、Smad3、CollagenI和Fibronectin的表达,下调db/db肾脏miRNA21的表达,上调miRNA29b的表达,抑制肾脏纤维化。3.糖肾方抑制db/db小鼠肾脏脂质沉积:油红O及Filipin染色发现db/db小鼠肾脏脂质明显沉积,给予糖肾方干预后显著减轻脂质沉积;肾脏组织胆固醇测定结果显示糖肾方可减少db/db小鼠肾脏胆固醇沉积。Western Blotting和real-time PCR结果显示,糖肾方可上调db/db小鼠中的PPARα及PGC-1α、LXR和ABCA1的蛋白及mRNA水平的表达,改善肾脏脂质沉积。4.糖肾方肾脏胆固醇流出的机制:体外实验结果显示,糖肾方可减少细胞胆固醇沉积以及上调PA刺激mTECs细胞中的PGC-1α、LXR和ABCA1的蛋白及mRNA水平的表达;利用Abcal-siRNA使细胞低表达ABCA1后,可抑制糖肾方减少细胞胆固醇沉积的作用及糖肾方上调ABCA1的蛋白及mRNA表达水平的作用。结论:糖肾方可作用于TGF-β1及其下游Smad3转录因子,抑制肾脏纤维化;作用于PGC-1α,通过PGC-1α/PPARα通路调节肾脏脂质氧化以及PGC-1α/LXR/ABCA1通路调节ABCA1介导的肾脏胆固醇流出,减轻肾脏脂质沉积。由此提示我们糖肾方改善db/db小鼠肾损害可能是通过调节纤维化以及脂质紊乱等多种途径实现的。