论文部分内容阅读
背景和目的尿路感染(Urinary tract infection,UTI)是目前世界范围内最为常见的细菌感染性疾病,是由于病原微生物侵入泌尿系统并繁殖而引起的炎症反应,其中约80%的UTI由尿路致病大肠杆菌(Urinary Pathogenic E.coli,UPEC)引起。在美国,UTI每年诊断出的发病率极高,其中男性发病率超过3%,女性发病率超过10%(其中在年龄>65岁的女性中,发病率增加到20%),而超过60%的女性在一生中都会发生至少一次UTI,更有20%-30%的女性患者频繁复发。尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是引起尿路感染最常见的病原菌,UPEC在鞭毛、菌毛,毒素等侵袭因子的协助下致病。UPEC分泌的一种外毒素:α-溶血素(α-hemolysin,HlyA)是一种高效的溶血毒素,典型的RTX(repeats-in-toxin)家族成员。HlyA与尿路感染和败血症有关,其在体内合成原毒素ProHlyA后,会被两个内部赖氨酸(Lys-563和Lys-689)酰化激活,酰化使毒素与细胞膜的结合不可逆转,引发一系列导致溶血的反应。细胞自噬作为一种降解途径,在各种生物中的主要生理作用是通过产生氨基酸来适应营养饥饿,当刺激发生时,细胞自噬过程会通过双膜细胞器将细胞内物质传递给溶酶体,称为自噬小体,溶酶体降解自噬小体后产生氨基酸以代偿各种刺激。除了饥饿期间增强的自噬外,基础自噬对于静止细胞的细胞内能量稳态也很重要。需要注意的是,LC3蛋白可作为细胞自噬发生的标志。除了这些基本的作用,自噬还参与了细胞内的细菌、抗原呈递、肿瘤抑制、和细胞死亡等过程,越来越多的研究表明,细胞自噬参与了细菌感染的过程,并涉及细菌的排出机制。当致病性尿路大肠杆菌(UPEC)感染膀胱上皮细胞(BECs)时,它们可作为自噬的靶标,但由于它们具有中和溶酶体pH的能力,因此避免了被自噬小体送入溶酶体后被降解。这种变化被定位于溶酶体的瞬时受体电位阳离子通道--粘蛋白Trp通道3(TRPML3)检测到,然后,TRPML3的激活自发地启动溶酶体的胞吐作用,导致由外泌体包裹的细菌被排出,另外,其中一部分细菌被溶酶体降解,另外一部分以QIR的形式继续储存在细胞中。尿路感染一直以来都是困扰全世界的医生和患者的难题,目前对于研究尿路感染的发病机制以及如何有效的预防和治疗是国内外学者的研究热点和重点。可以预见,如能有效的预防和治疗尿路感染,必将产生巨大的社会效益和经济效益。方法1.以“urinary tract infection”、“Urinary tract pathogenic Escherichia coli”、和“尿路感染”、“泌尿系感染”、“尿路致病性大肠杆菌”等为检索词对Pubmed、中国知网、万方数据库进行系统检索。收集2017年1月截止到2018年12月国内外公开发表的(包括我院在内)我国关于尿路感染及病原菌菌株分型的研究,统计其确诊尿路感染,并且中段清洁尿液尿培养出病原菌菌株的病人,收集并整理阳性菌株各种细菌的占比。2.以UPEC建立小鼠尿路感染模型,并收取感染后的小鼠尿液,利用细菌涂布平板法检测膀胱细菌负荷量以验证模型建立是否成功。3.在组织及细胞水平,利用Western-Blot技术验证UPEC感染与细胞自噬是否存在相互作用关系。4.用HlyA缺乏的HDM菌株建立小鼠尿路感染模型,以同样的方法验证模型建立是否成功,并从组织及细胞水平验证HlyA缺乏的HDM菌株与细胞自噬的关系。5.利用细菌驱逐实验验证细菌的排出是否与细胞自噬相关,验证细菌的排出与细胞自噬的关系。6.利用MTT法检测并对比细胞活性,以验证细菌的排出是否是因为感染后的细胞裂解而释放出的。结果1.共收集到5217例阳性菌株,其中,以大肠杆菌占比最多,共计3395株,占比为65.08%,其次为屎肠球菌,共计467株,占比为8.95%,其余的主要包括粪肠球菌365株,肺炎克雷伯杆菌312株,真菌153株,占比分别为7.00%,5.98%,2.93%,其他类别菌株为525株,占比为10.06%。2.建立由UPEC感染导致的小鼠尿路感染模型,收集感染后24小时的尿液行细菌涂布平板发现,感染组的小鼠膀胱细菌负荷量远远高于对照组(P<0.05)。3.收取感染后的小鼠膀胱组织并提取组织蛋白,体外UPEC感染膀胱上皮细胞(BECs,5637系)后提取细胞蛋白,行Western-Blot法检测细胞自噬的Maker蛋白LC3发现,无论体内还是体外的LC3表达量均高于正常组(P<0.05)。4.同样的方法利用HDM菌株感染,得到的结果发现,HDM感染组的LC3表达量与正常组基本无差异(P>0.05)。5.细菌驱逐实验结果表明,未使用细胞自噬抑制剂的UPEC感染组细菌排出量明显高于使用了抑制剂的感染组(P<0.05)。6.利用MTT法检测未使用抑制剂的UPEC感染组和使用了抑制剂的感染组的细胞活性发现,两组细胞活性并无差异(P>0.05)。结论1.目前国内尿路感染的主要致病菌仍然为大肠杆菌。2.UPEC依赖其侵袭因子HlyA可以促进细胞自噬的进程。3.细胞自噬的促进可以增加宿主细胞对于细菌的排出,但这个过程并非是导致细胞裂解而引起细菌的释放。