研究背景S100A8/A9蛋白,是一种新发现的在炎症反应调控过程中,特别是天然免疫调节中起关键作用的炎症相关蛋白。S100A8/A9又叫做髓样相关蛋白-8/14(Myeloid-related protein-8/14, MRP8/14)、钙卫蛋白(Calprotecin)、27E10抗原(27E10antigen)或白细胞蛋白L1(leukocyte protein L1)。S100A8/A9是由S100A8, S100A9两种蛋白组成的异源二聚体。S100A8和S100A9是最早被发现于中性粒细胞中的具有免疫原性的蛋白,属于钙结合蛋白S100家族成员,EF手型(EF-hand)结构为蛋白重要的功能结构域,可结合Ca2+使蛋白的构象发生改变,暴露出与靶蛋白相互作用的位点,从而发挥相应的生物学功能。S100A8/A9的表达具有组织和细胞特异性,主要表达在髓样细胞(myeloid cells)内,在中性粒细胞内表达最多,占中性粒细胞胞浆可溶性成分的50%,在单核细胞内也有组成性表达。在特定环境下,血小板、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、心肌细胞及恶性肿瘤细胞也可诱被导表达S100A8/A9,但在T细胞中不能被诱导性表达,提示其主要参与先天性免疫应答。近年来S100A8/A9在炎症反应及炎症相关疾病中的作用逐渐受到重视。有临床观察报道显示S100A8/A9在不稳定性心绞痛、心肌梗死病人血清中明显升高；动脉粥样硬化斑块急性破裂和ST-段抬高性心梗的病人的血小板内表达的S100A9的量远远高于稳定性心绞痛和非血栓栓塞性冠心病的病人；转录组学研究发现血浆S100A8/A9可以作为一种新的心肌梗死的预测指标,预测初发和再发的心血管事件的风险性。以上这些研究结果提示S100A8/A9可能与冠心病,尤其是其中的炎症反应机制方面有密切联系。冠心病已成为威胁人类健康的头号杀手,并且在中国也呈现出上升趋势。心肌再灌注治疗是治疗急性心肌梗死治疗的关键,临床实践已充分证明,冠状动脉有效的再灌注治疗对保存或改善心肌梗死病人的左心室功能有十分重要的意义,可挽救濒临死亡的心肌,限制或缩小梗死范围,减少或限制左室重构的发生,明显改善急性心肌梗死的病死率。然而,再灌注后可引起一系列变化,如钙离子沉积、氧自由基生成过多,过度炎症等,可能导致不可逆的线粒体损伤,引起心肌细胞死亡。因此,如何减轻心肌缺血再灌注损伤已成为缺血性心脏病防治和临床心脏病介入治疗的一个重要课题。目前缺血再灌注损伤的病理生理学机制尚未完全阐明,其中缺血再灌注过程中的炎症反应被认为是不容忽视的因素。文献报道,在急性心肌梗死再灌注的前6个小时内,组织损伤所释放的中性粒细胞趋化物会吸引中性粒细胞浸入梗塞区域,并在之后的24小时内,浸润的中性粒细胞在细胞粘附分子等的促进下,迁移到心肌组织中。一方面,趋化的中性粒细胞可导致血管栓塞,进一步加重组织的缺血缺氧。另一方面,趋化的中性粒细胞在组织内活化,释放大量炎症介质、活性氧、胶原酶、弹性蛋白酶等,导致组织的进一步损伤和破坏,使梗死面积扩大。目前单纯的抗中性粒细胞粘附抗体和补体活化抑制等治疗还不能有效的抑制再灌注损伤时的炎症反应。而S100A8/A9作为一种重要炎症起始和扩大因子,是否也参与了缺血再灌注损伤过程,是否能够作为一种新的靶点,抑制再灌注损伤时的炎症反应所带来的组织损伤和灌流障碍是我们所关注的问题。另外,由凋亡介导的损伤也是心肌缺血再灌注损伤的重要因素。再灌注后期凋亡的发生率较高,并且主要是出现在坏死心肌的周围区域,所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用,而高浓度S100A8/A9有促凋亡作用,因此是否将其作为抑制心肌细胞凋亡的靶点可能是防治心肌缺血再灌注损伤的一条重要途径。综合上述,S100A8/A9是炎症的起始和促进因子,同时高浓度的S100A8/A9本身也具有促凋亡作用,如果可作为缺血再灌注损伤过程中较为上游的作用靶点,中和其促凋亡作用,阻断过度的炎症反应,从而减少心肌细胞的死亡,对于改善再灌注治疗效果具有重要的研究意义。研究目的本课题首先关注在研究心梗模型的自然病程中,S100A8/A9在心肌组织内.表达的规律,初步探讨S100A8/‘A9在心梗组织中的来源、演变规律和参与的病程阶段；其次研究心肌在缺血-再灌注过程中表达S100A8/A9的情况,初步探讨S100A8/A9是否参与了缺血-再灌注损伤过程；最后研究S100A8/A9对心肌细胞的直接效应上,主要集中在其对诱导心肌凋亡的作用上,初步探讨再灌注损伤时S100A8/A9是否参与了诱导心肌凋亡的过程。研究方案1.S100A8/A9在急性心肌梗死模型中的表达构建小鼠左冠状动脉结扎的经典心肌梗死活体实验模型,并用分离的原代心肌细胞缺氧处理作为离体模型,通过荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组化的方法检测梗死后心肌组织S100A8/A9时空分布特征、原代心肌缺氧时表达S100A8/A9情况,以及该模型下伴随的部分信号通路激活情况。2.缺氧-复氧和氧化应激对心肌细胞S100A8/A9表达的影响分离原代心肌细胞,用缺氧-复氧及双氧水氧化应激处理作为缺血-再灌注的离体模型,利用免疫印迹的方法探讨S100A8/A9在原代心肌细胞缺氧-复氧及氧化应激状态下表达及部分激酶激活情况。3.外源性S100A8/A9对心肌细胞的促凋亡作用分离原代心肌细胞,用外源S100A8/A9蛋白刺激,利用MTT法及免疫荧光技术初步研究S100A8/A9对心肌细胞存活及凋亡的影响。结果1.S100A8/A9在急性心肌梗死模型中的表达1.1成功构建小鼠左冠状动脉结扎模型后,检测S100A8/A9在假手术组及心梗后30min,2h,6h,12h,24h,3d,7d时S100A8, S100A9的]mRNA以及蛋白的表达情况。结果表明S100A8/A9表达量各结扎组和假手术组相比,2h-24h以及7d表达量均高于sham组,差异具有显著性(P<0.05)。S100A8/A9在6h-12h显著增高,为假手术组的80-90倍,并于心梗后24h达峰值,为假手术组的130倍,在心梗后3-7天仍有一定程度的升高,约为假手术组的5倍。蛋白水平的检测与mRNA水平的变化相一致,6h开始明显升高,在6-12h内达高峰,持续至24h,于第3天开始明显下降。1.2选取sham组与心梗后24h组作免疫组化和HE染色,结果显示,MI组梗死组织部位有明显的S100A8/A9分布(棕褐色颗粒),而sham组无染色阳性颗粒。同时我们做了sham和MI组的阴性对照(即仅加入二抗孵育显色),排除S100A8/A9抗体非特异性结合的可能。免疫组化阴性对照组与抗体组比对时可观察到,S100A8/A9抗体显色区与阴性对照组炎症细胞浸润区重叠,而非分布在梗死的中心地带。HE染色显示,与sham组相比,MI组心肌梗死部位发生凝固性坏死,心肌细胞肿胀,边界不清,肌纤维紊乱,胞浆嗜伊红性增高,核溶解或消失,融合呈均质红染物。梗死灶边缘可见充血带及中性粒细胞浸润。1.3免疫印迹检测NF-kB, JAK1, JNK信号通路活化时间。NF-kB在心梗后30min已有激活,在6-12h激活最为明显,激活持续的时间较为持久；而JAK1激活时间较早,在心梗后30min已有激活,在2-6h有一高峰；JNK在心梗后12-24h有较明显升高,但较NF-kB和JAK1活化的时相晚且相对较弱。1.4分离原代心肌单纯缺氧刺激4h,检测了mRNA水平及蛋白水平S100A8/A9与对照组比无差异(P>0.05)。免疫印迹检测p38信号通路,显示p38信号通路在缺氧4h时已有明显活化。2.缺氧-复氧和氧化应激对心肌细胞S100A8/A9表达的影响2.1设置常氧对照组、缺氧后分别复氧10min,2h,4h组,检测S100A8/A9mRNA及蛋白水平变化。结果显示,缺氧后复氧2h-4h时mRNA均有增高,约为对照组的3倍,虽在统计学上无差异(P>0.05),但蛋白水平可观察到明显增高,尤其是复氧4h组。2.2设置0.2mM,2mM两种浓度及10min,2h两种时间双氧水刺激,检测mRNA及蛋白水平S100A8/A9变化。结果与对照组相比,0.2mmM双氧水处理2h组mRNA升高60-90倍,2mM双氧水处理2h时达对照组的20倍。蛋白水平的变化与mRNA水平变化相一致。2.3心肌细胞在缺氧-复氧及双氧水氧化刺激的过程都伴有p38信号通路的激活。在缺氧4h后复氧2h,4h都有明显活化；不同浓度双氧水刺激下也有不同程度的活化。3.外源性S100A8/A9对心肌细胞的促凋亡作用3.1构建小鼠S100A8、S100A9原核表达载体,His亲和树脂层析纯化目的蛋白,结果显示得到较纯净的重组融合蛋白His-S100A8, His-S100A9,蛋白大小分别约11.11KD和13.8KD,与理论值一致,所得浓度满足实验要求。3.2纯化的S100A8/A9蛋白在体外反应形成二聚体后,分别以50ug/ml和’100ug/ml浓度刺激原代心肌细胞48h,而对照组处以PBS。结果表明,与对照组相比,S100A8/A9处理组心肌存活率下降约8-10%(**P<0.001),且随着S100A8/A9刺激浓度的升高,心肌细胞的存活率逐渐降低。3.3纯化的S100A8/A9蛋白在体外反应形成二聚体后,以50ug/ml浓度刺激心肌细胞48h,可见光及荧光下观察心肌细胞形态,S100A8/A9处理组于光镜下发现心肌细胞体积缩小且变狭长,荧光镜下发现心肌细胞核空泡产生,染色质固缩并着边。结论1.S100A8/A9在心梗部位的高表达来源可能是梗死周边带的存活心肌以及浸润后活化的炎症细胞,而非梗死的心肌本身。2.S100A8/A9在心肌缺血-再灌注损伤过程中可能有重要作用,其中再灌注后存活心肌表达的S100A8/A9可能是趋化中性粒细胞过度聚集并活化的起始因素。3.外源性的S100A8/A9可降低心肌细胞存活率,并诱导心肌细胞凋亡。