文章从以下三部分就基于比色法检测蛋氨酸亚砜还原酶活性新方法的建立及应用进行了综述。　　第一部分 基因重组鼠源性蛋氨酸亚砜还原酶的构建、表达和纯化　　目的:蛋氨酸亚砜还原酶A(methionine sulfoxide reductase A,MsrA)是蛋氨酸亚砜还原酶家族的一员,能够特异性的还原结合型和游离型的S-型蛋氨酸亚砜,在生命体内调节氧化还原状态,从而在对抗氧化应激的细胞保护中发挥重要作用。本实验室拟对含有穿膜肽TAT的MsrA蛋白作为新型生物药物进行开发,因此利用原核载体构建并表达TAT-rMsrA序列的重组蛋白。　　方法:含有鼠源性 MsrA(rMsrA)表达序列的重组质粒(pcDNA3.1-rMsrA)由瑞士苏黎世大学教授Dr.Bertrand Friguet(Universite′Paris7-Denis Diderot, France)友情赠送。通过 PCR技术获得编码 rMsrA的cDNA。5’端引物包含一个BamHI位点(5-AAAGGATCCATGCTCTCCGCCTCCAGAAGGAC-3’引物),3’端引物含有一个XhoI位点(5’-AAACTCGAGTTACTTTTTAATGGCCGTGGGACAGG-3’)。扩增后的产物和PET-32a(+)蛋白表达载体均用BamHI和XhoI消化,通过T4 DNA连接酶将表达完整的rMsrA编码序列的PCR片段连接到PET-32a载体的启动子下游,构建得到Trx-His-TAT-MsrA-融合蛋白。插入的克隆核苷酸序列通过至少两次每个方向的测序得到确定。[1]提取质粒后,转染 BL21表达载体,使用平板培养筛选出转染成功的菌落,扩增并诱导大量表达,提取重组蛋白,并采用Ni-层析柱纯化得到融合蛋白。使用轻链肠激酶酶切处理后再次过柱纯化,得到纯化的基因重组TAT-MsrA酶。　　结果:SDS-PAGE电泳染色和Western Blotting结果显示,MsrA重组蛋白表达载体构建成功,并且可以用于大量表达目的蛋白。此方法得到的MsrA重组蛋白纯度高达92％,抗原活性显示阳性反应。　　结论:使用该基因工程方法可以成功制备高纯度和活性的MsrA酶。　　第二部分 比色法检测蛋氨酸亚砜还原酶催化活性　　目的:传统检测MsrA酶活性的方法主要依赖于液闪计数仪或HPLC-MS检测系统,但由于这些仪器普及型不强,样本前处理复杂,检测步骤费时,不适用于快速检测和监控基因工程重组蛋白的酶活性。为快速检测和监控MsrA酶活性,本研究基于MsrA在体外催化 DTT还原蛋氨酸亚砜的反应机制,建立一种通过化学显色法快速检测MsrA催化活性的新方法。通过DTT和DTNB的化学反应,产物TNB在412 nm波长下检测吸光度A值,使用酶标仪可以简单快速的监测DTT的消耗,从而间接反映MsrA的催化活性(吸光度大小与含量正相关)。　　方法:通过LC-MS方法,检测实验预设的标准反应体系发生生物催化反应的合理性。通过绘制DTT-DTNB的标准反应曲线,确定DTT准确检测的浓度范围。最后通过酶浓度、时间的量效反应曲线确定酶反应的饱和浓度和饱和时间,确定最佳反应体系的条件。　　结果:LC-MS的检测结果显示:在50μM DTT存在的条件下,MsrA能够成功催化L-MetO还原成Met。DTT-DTNB标准曲线说明DTT在0-200μM范围内,OD412nm(412 nm处吸光度)对DTT浓度作回归曲线,方程为y=0.0138x-0.0073,r2=0.9999。酶的浓度和时间曲线确定了500μM L-MetO,50μM DTT,pH8.0的条件下,MsrA的饱和浓度和饱和时间分别为0.1μg/μL和2 h。　　结论:根据体外 MsrA催化的蛋氨酸亚砜与 DTT的生化反应,建立一种基于DTT-DTNB反应的体外快速检测MsrA活性的化学比色法。　　第三部分 比色法检测甲基亚砜类物质含量　　目的:甲基亚砜类物质是MsrA的特异性底物,因其结构稳定,无特异光学吸收性质等,难以快速简易的检测其在溶液中的浓度。本实验旨在利用酶促反应中,底物初始浓度和酶促反应的初速度成正比的特性,建立一种通过基于酶促反应快速检测甲基亚砜类化合物浓度的新方法,以代替操作复杂,仪器要求较高的液相色谱-质谱或气相色谱-质谱联用方法。　　方法:一定时间内,酶促反应的初速度保持不变,因此 DTT的消耗量和反应时间成正比。在实验室条件下,先测定酶促反应初速度保持不变的时间点;然后在此时间点,检测单位时间内 DTT的消耗量,反映酶促反应的初速度。进一步建立不同底物(DMSO、MetO和舒林酸)的初始浓度和酶促反应初速度的线性相关曲线。　　结果:从时间-反应曲线可知,0-120 min时间范围内,DTT的消耗量和反应时间成正比例线性关系,说明酶促反应的初速度保持不变。因此,我们选择了60 min作为时间点,检测不同底物浓度下 DTT的消耗量,测定初始浓度和酶促反应初速度的线性回归曲线。DMSO和L-MetO的效应-浓度曲线方程分别为y=0.0002x+0.008,r2=0.986和y=0.0006x+0.0147,r2=0.9846。舒林酸在修正非酶影响因子之后,0-100μM范围内反应方程式为y=0.0094x+0.0925,r2=0.976。　　结论:本实验建立了一种基于MsrA生物酶促反应的快速检测甲基亚砜类化合物浓度的新方法,该方法经过对多种底物的检验,证实在限定的浓度范围内(L-MetO0-640μM,DMSO0-800μM,舒林酸0-100μM)能够快速的检测处溶液中的甲基亚砜类物质的含量。该方法可广泛应用于化工和医药领域对于甲基亚砜类物质如蛋氨酸亚砜、DMSO和舒林酸等物质的快速检测。