论文部分内容阅读
研究背景纳米氧化锌广泛应用于口腔医学领域。动物体内研究表明,其颗粒能通过血脑屏障和神经通路进入个体中枢神经系统(CNS),并导致脑组织损伤。目前引起损伤的分子机制虽尚无定论,但线粒体损伤是公认的的早期毒性表现。线粒体自噬是一种选择性清除多余或受损线粒体的途径,在调节细胞内线粒体数量、维持线粒体正常功能等方面发挥重要作用。那么,纳米氧化锌引起的CNS毒性过程中,是否有线粒体自噬参与?目前尚未见到相关研究对其进行探讨。研究目的本项目拟通过基因干扰技术构建PINK1基因沉默的BV-2细胞模型,然后通过比较纳米氧化锌处理后,两种类型细胞在增殖能力、细胞内线粒体自噬的启动、线粒体膜电位的变化、以及线粒体自噬相关蛋白的表达水平等方面的差异。探讨在纳米氧化锌颗粒导致的BV-2细胞毒性中,PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬所发挥的作用。材料与方法采用TEM、DLS、Zeta、BET测量仪及X射线能谱仪对材料进行表征。通过RNAi技术获得PINK1基因沉默细胞株,用含不同浓度纳米氧化锌培养基分别处理正常细胞,通过CCK8法确定最佳浓度。然后根据纳米氧化锌作用时间,将野生型和基因沉默型两种细胞各分为正常对照、4、8、12、24 h组。采用CCK8法、ROS活性氧、JC-1线粒体膜电位检测等手段观察纳米氧化锌的细胞毒性。采用Western Blot检测纳米氧化锌对细胞内LC3、P62、Beclin1、总Parkin,胞浆Parkin,线粒体parkin及总PINK1等自噬相关蛋白的表达水平影响。采用TEM、免疫荧光、GFP-LC3质粒转染等观察细胞内线粒体损伤及自噬体生成情况。结果1.纳米氧化锌颗粒呈六棱柱形,原始粒径50 nm左右,平均水合粒径约500 nm左右,电位值为32.9 mV,带正电荷。XRD结果表明其图谱与标准对照基本一致。2.20、25μg/mL组细胞活力分别下降50%和80%,而10 μg/mL以下组间活力无统计学差异(P>0.05)。3.10 μg/mL纳米氧化锌处理细胞4、8、12及24 h后,细胞ROS水平显著升高(P<0.01);线粒体膜电位降低(P<0.01);MDC荧光增强(P<0.01);差异均有统计学意义。4.纳米氧化锌处理BV-2细胞4、8、12、24 h。镜下LC3II光点数量增加(P<0.05)。Western Blot条带LC3II/LC3I比值增大,Beclin1表达上调,P62表达下调,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。细胞总Parkin无显著变化(P>0.05),胞浆Parkin表达下降,其中8、12、及24h具有统计学意义(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.01)。PINK1表达水平升高,各组均具有显著统计学差异(P<0.05)。5.野生型、转染vector和PINK1沉默的三种细胞的生长曲线基本一致。纳米氧化锌处理后,基因沉默型细胞活力均低于同组的野生型细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。6.在纳米氧化锌处理后,与野生型细胞相比,基因沉默型细胞线粒体膜电位下降幅度更大,线粒体Parkin含量变低,而胞浆Parkin水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论1.纳米氧化锌可引起BV-2细胞发生氧化应激、导致线粒体损伤和细胞自噬。2.纳米氧化锌可以诱导BV-2细胞发生线粒体自噬。3.PINK1/Parkin通路在调节纳米氧化锌引起的线粒体自噬过程中起到关键作用,线粒体自噬是BV-2细胞抵御纳米氧化锌颗粒毒性的重要防护性机制之。