作为新一类的分子靶向标志物,微小RNA (microRNA, miRNA)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的诊断和生物治疗上的应用前景非常广阔。目前已发现若干直接或间接与NSCLC的发生和发展、诊断、分期、进展和预后等相关的miRNAs,但许多miRNA与NSCLC的相互关系及分子机制仍不明确,故探求miRNA在NSCLC中的作用机制已成为当前研究的热点和重点。miR-542-5p与肿瘤的关系研究不多,已有研究发现miR-542-5p在神经母细胞瘤中呈低表达,与患者的不良预后密切相关,体外实验结果显示,过表达miR-542-5p可抑制神经母细胞瘤细胞的增殖,侵袭和转移,推测miR-542-5p可能在神经母细胞瘤中行使“抑癌”miRNA的功能。但到目前为止,miR-452-5p在NSCLC人群中的研究未见报道。因此,本课题将探讨miR-542-5p在NSCLC中的表达及其与临床病理参数的意义,预测miR-542-5p靶基因网络,继而构建鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤(Chick Chorioallantoic membrane, CAM)动物模型,探索miR-542-5p在NSCLC细胞生长,血管生成的作用及初步分子机制,为进一步开展NSCLC的肿瘤生物学相关研究提供了良好的技术平台。目的1检测miR-542-5p在NSCLC细胞及组织中的表达及临床意义。2利用生物信息学预测并分析miR-542-5p的靶基因网络并行信号通路等分析。3使用体内实验(CAM),探讨miR-542-5p在NSCLC肿瘤细胞生长及血管生成中的作用及潜在机制。方法1.miR-542-5p在NSCLC中的表达收集125例NSCLC及癌旁非癌肺组织样本,其中101例肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD),23例肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma, LUSC),采用实时荧光定量PCR技术检测miR-542-5p的表达水平,分析miR-542-5p的表达与NSCLC的临床病理学特征的关系,初步探讨miR-542-5p在NSCLC中的临床意义。2.miR-542-5p潜在靶基因信号通路及网络分析2.1通过miRNA预测软件(miRWalk, miRanda, Microt4, miRDB, mirbridge, miRMap, RNAhybrid, miRNAMap, PITA, Pictar2, RNA22, TargetScan)预测miR-542-5p的靶向作用基因,利用DAVID分别进行GO富集分析、KGEE通路分析、PANTHER通路分析。2.2用软件Cytoscape_v3.3.0绘制GO分析网络图, 在http://string-db.org/网站上绘制靶蛋白网络图,并提取hub gene。2.3通过GSEA软件构建的分子标签数据库(Molecular Signatures Database, MSigDB)对452个靶基因进行富集分析。通过来源于National Cancer Institute的NCI-60 cell lines的数据,以基因表达图谱的形式进行靶基因注释,在定义的功能分组中显示相互的表达趋势。3. miR-542-5p在NSCLC CAM中的作用及初步机制研究3.1实时荧光定量PCR方法检测四株肺癌细胞系(A549、PC9、H1299、 H460)中筛选出miR-542-5p表达量最低的肺癌细胞株进行转染。3.2构建LV-hsa-miR-542的慢病毒载体,转染至肺癌细胞株H460,构建miR-542-5p的过表达细胞模型。3.3通过构建NSCLC CAM模型从动物模型角度模拟人体NSCLC的生长发展,测量瘤块大小,并利用Image-Pro Plus软件测量不规则血管面积及开窗面积,计算比值,包埋瘤块制成石蜡组织后,组织切片常规HE染色和免疫组化表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)、 D2-40染色,以研究miR-542-5p对NSCLC肿瘤形成和血管生成的影响,进一步初步探讨其在肿瘤中的作用机制。结果1.miR-542-5p在非小细胞肺癌中的表达1.1 miR-542-5p在125例NSCLC中的癌组织(1.952±1.507)中表达低于癌旁非癌肺组织(4.568±1.993)(t=-11.703,P<0.001)；在101 LUAD中的癌组织中的表达(1.868±1.472)显著低于癌旁非癌组织(4.682±2.056；t=-11.183,P<0.001)；在23例LUSC癌组织中的表达(2.355±1.647)显著低于癌旁非癌组织(4.103±1.851; t=-3.383, P=0.002)。ROC曲线示在NSCLC石蜡组织中miR-542-5p曲线下面积为0.799(95%CI0.721-0.877,P<0.001),其中在LUAD组织中miR-542-5p曲线下面积为0.832(95%CI0.753±0.911,P<0.001)。1.2在125例NSCLC病人中,miR-542-5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表达水平(1.292±1.101)低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(2.822±1.536；t=6.488,P<0.001),在有血管浸润阳性者(1.475±1.305)的表达低于血管浸润阴性组(2.138±1.545；t=2.247,P<0.001)的病人,在淋巴结转移阳性组(1.504±1.266)中的表达低于淋巴结转移阳性组(2.506±1.604；t=3.905, P<0.001)。Spearman相关性分析表明,miR-542-5p的表达水平与TNM分期(r=-0.505,P<0.001)、淋巴结转移(r=-0.332,P<0.001)及血管浸润(r=-0.199,P=0.026)呈负相关。1.3在101例LUAD病人中,miR-542-5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表达水平(1.142±0.935)低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ(2.810±1.516；t=6.417, P<0.001)的病人,在有血管浸润(1.375±1.30)中的表达低于无血管浸润(2.087±1.497；t=2.286,P=0.024)的病人,在有淋巴结转移(1.333±1.095)中的表达低于无淋巴结转移(2.085±1.085；t=-2.477,P=0.027)的病人,在有吸烟史的病人(3.065±1.542)中的表达高于无吸烟史的(2.535±1.616；t=4.265, P<0.001)。Spearman指数分析表明,miR-542-5p的表达水平与TNM分期(r=-0.564,P<0.001)、淋巴结转移(r=-0.408,P<0.001)及血管浸润(r=-0.224,P=0.024)呈负相关。1.4在23例LUSC病人中,miR-542-5p的表达水平与临床特征相关性不明显。1.5在NSCLC组织中,miR-542-5p在EGFR阳性组(0.739±0.407)中的表达显著低于EGFR阴性组(3.049±1.194；t=7.753,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=-0.723,P<0.001)。其中在LUAD组织中miR-542-5p在EGFR阳性组(0.836±0.373)中的表达低于EGFR阴性组(3.180±0.952；t=10.098,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=-0.818,P<0.001)；在LUSC组织中miR-542-5p在EGFR阳性组(0.436±0.345)中的表达低于EGFR阴性组(2.888±1.448；t=6.543,P<0.001)的病人,Spearman相关分析结果示EGFR蛋白表达与miR-542-5P呈负相关(r=0.828,P<0.001)。1.6以miR-542-5p在NSCLC组织中的表达量的中位数(3.260±2.197)为分度将其分为高表达组(4.568±1.993)和低表达组(1.953±1.507)。K-M生存曲线分析发现miR-542-5p低表达组的50例NSCLC病人(11.274 ±1.387 months)与高表达组的7例病人(35.714±3.469 months)相比,预后更差(t=-6.219,P<0.001)。2.miR-542-5p潜在靶基因网络生物信息学分析2.1通过12个预测软件预测出57233个miR-542-5p预测靶基因,按至少同时出现在六个软件预测为条件,筛选出452个靶基因。2.2 DAVID软件测出miR-542-5p预测的GO分析结果中,生物过程GO分析(GOTERM BP FAT)中有147条通路信息,其中最显著的前三条通路如下：RNA聚合酶引物调控的转录通路(regulation of transcription from RNA polymerase II promoter；GO:0006357,P=0.002)；蛋白质定位通路(protein localization；GO:0008104,P=0.002)；Wnt受体信号通路(Wnt receptor signaling pathway；GO:0016055,P=0.002).细胞组成GO分析(GOTERM CC FAT)中有15条,其中排前三条通路如下：神经元投射通路(neuron projection；GO:0043005,P=0.003)；突触调控通路(synapse； GO:0045202,P<0.001):体元投射(cell projection；GO:0042995,P<0.001).分子功能GO分析(GOTERM MF FAT)中有37条,其中三条最显著通路如下：蛋白质糖基绑定(protein C-terminus binding；GO:0008022,P= 0.003):转录调节活性(transcription regulator activity:GO:0030528,P= 0.017)；蛋白质自联(protein self-association；GO:0043621,P=0.037).2.3 DAVID软件测出miR-542.5p参与的KEGG通路分析13条通路信息,其中三条最显著为：卵母细胞成熟分裂调控通路(Oocyte meiosis； hsa04114,P=0.01):扩张性心肌病调控通路(Dilated cardiomyopathy； hsa05414,P=0.012):黑素原生成调控通路(Melanogenesis；hsa04916, P=0.018).2.4 DAVID软件测出miR-542-5p参与的PANTHER通路分析有12条通路信息,其中参与的最显著三条通路为：GABA.B Ⅱ受体信号(GABA-Breceptor Ⅱ signaling; P05731, P=0.001);谷氨酸受体组第三途径(Metabotropic glutamate receptor group Ⅲ pathway; P00039, P=0.013);胰岛素／胰岛素样生长因子通路蛋白激酶B信号级联(Insulin/IGF pathway-protein kinase B signaling cascade; P00033, P= 0.024)。2.5452个靶基因在String上分析结果显示：GO分析中miR-542-5p参与的生物过程通路(GOTERM BP FAT)中有121有意义的作用结果(P<0.05),其中参与的前三条依次为神经系统的发展(nervous system development) (GO:0007399),神经(nervous) (GO:0022008),细胞分化(cell differentiation) (GO:0030154);细胞组成通路(GOTERM CC FAT)中有20条有意义的作用结果(P<0.05),其中参与的前三条依次为细胞反射(cell projection) (GO:0042995),神经反射(neuron projection) (GO:0043005),神经系统的部分(neuron part) (GO:0097458);分子功能通路(GOTERM MF FAT)中仅参与蛋白绑定(protein blind) (GO:0005515)的作用(P<0.05)。KEGG通路中有7条作用结果,其中参与的前三条依次为吗啡慢性中毒(Morphine addiction);可卡因成瘾(Cocaine addiction),心肌细胞的肾上腺素信号通路(Adrenergic signaling in cardiomyocytes) (P< 0.05)。并通过网络分析及网站评分信息检测出21个hub gene,分别为RMT8, ADAMTS8, MASP1, HOXC9, ARTN, NPDC1, CASC3, NCDN, ARPC4, PGPEP1, TNNI3K, SLC24A3, EPS8L2, FARSA, PDDC1, PLEKHM1, UNKL, PRDM9, ISYNA, BCL2L1。2.6通过将靶基因注释在NCI-60 cell lines不同癌症细胞系中的表达图谱,显示出多个靶基因在HOP92, HOP62; NCI-H226; NCI-H23; NCI-H322; NCI-460及EKVX肺癌细胞系中高表达,依次为NSD1, ELF4, HOXA9, ABL1, ABL2, NOTCH1, TCF3, SEPT6, NUP214, CRTC1。3.miR-542-5p在NSCLC CAM中的作用及初步机制研究3.1细胞选择：选取miR-542-5p表达量最低的H460细胞进行移植瘤构建。3.2慢病毒转染：选取最佳转染浓度转染LV-hsa-miR-542慢病毒(浓度配比virus 10 μl+ENIS 290μl+ploy 1.25μl+complete 2.2 ml)和空载病毒(浓度配比virus 3 μl+ENIS 300μl+ploy 1.25 μl+complete 2.2 ml)后,实时荧光定量PCR检测H460(空白组),阴性组(空载病毒),LV-hsa-miR-542组中miR-542-5p的表达水平,发现miR-542-5p在转染组中过表达,转染有效(P<0.001)。3.3移植瘤结果统计：于25 ml培养皿中培养空白组,阴性组和转染组细胞株,各取两瓶长势良好且已满的细胞种入鸡胚,监测其瘤块和血管生长情况,第0天各组血管长势良好,第5天,瘤块大小：转染组(4.34±0.07mm3)与空白组(30.13±0.06 mm3)相比,明显受到抑制(t=543.260,P<0.001),阴性组(30.09±0.07 mm3)与空白组相比,无明显差异(t=1.312,P=0.260)。3.4血管生成：转染组(8.33±0.08)与空白组(16.94±0.11)相比,明显受到抑制(t=128.208,P<0.001)；阴性组(16.99±0.20)与空白组(16.94±0.11)相比,无明显差异(t=-0.612,P=0.573)均受到抑制。3.5 HE切片：镜下示转染组相比对照组,局部浸润不明显。通过免疫组化检测空白组和转染组的EGFR(11.220±0.536;6.680±0.536)、 VEGF(7.320±0.370;4.320±0.421)及D2-40(2.020±0.390；1.500±0.255)的表达情况：LV-hsa-miR-542组中EGFR(t=13.399,P<.001)、 VEGF(t=11.971,P<0.001)及D2-40(t=2.496,P=0.037)的表达明显减弱。结论1.miR-542-5p在NSCLC组织中呈低表达,在NSCLC的发生发展中具有一定影响,可能发挥抑癌基因的作用,并对NSCLC可能具有中度诊断价值。2.miR-542-5p的GO富集通路分析发现其分子功能,细胞结构及生物过程及KEGG通路分析和PANTHER通路的相关靶向作用通路信息,其中对KEGG通路及PANTHER通路中的相关基因进行网络分析发现miR-542-5p靶向作用于的VEZT, KIT, CAMK2D, WEE2, PARVA, LTK, CLCN3最有价值,可进行下一步的机制研究。通过String平台对miR-542-5p的452个靶基因分析发现其参与的各通路在神经系统中的作用很显著,并可参与相关如吗啡类药物中毒的生理反应过程。还通过靶基因注释发现了多个靶基因在肺癌细胞系中呈现出不同程度的高表达情况。对miR-542-5p的潜在靶向生物信息学分析为miR-542-5p对疾病发生发展的分子靶向作用机制提供了良好的理论平台。3.在NSCLC鸡胚绒毛膜尿囊膜移植瘤中,过表达miR-542-5p可抑制肿瘤大小及血管生成,进一步说明miR-542-5p在NSCLC的发生发展中可能起到抑癌基因的作用在体内实验发现：miR-542-5p表达与EGFR, VEGF及D2-40的表达呈负相关,推测miR-542-5p可能参与某种通路调节EGFR, VEGF及D2-40的表达,从而影响肿瘤的局部浸润及血管生成。但具体分子机制有待进一步深入研究。