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目的以往研究报道宫颈癌组织中降钙素基因相关肽基因(calcitonin-related peptide, CALCA)的启动子区发生高甲基化,并提示其基因转录表达下调或蛋白质表达缺失。人乳头瘤病毒16 (HPV16)持续感染是宫颈癌发生的重要因素,但是对CALCA基因表达水平的影响机制尚未查证。本课题拟利用维吾尔族妇女宫颈癌标本资源,研究宫颈病变病理进程与CALCA蛋白表达水平变化的关系,同时选择HPV16阳性宫颈癌细胞和RNAi技术,研究CALCA基因甲基化对HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系。方法(1)选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立稳定表达HPV16E7-siRNA的RNAi细胞模型。(2)以SiHa细胞和RNAi细胞模型的基因组DNA,选择CALCA基因启动子区富含CpG岛屿的目标片段,经引物设计、PCR扩增、克隆与测序,研究RNAi抑制HPV16-E7表达后,CALCA基因甲基化状态的可逆性程度。(3)收集维吾尔族妇女宫颈炎、低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)、高度鳞状上皮内瘤变(HSIL)和鳞癌(CSCC)患者的石蜡包埋组织标本104例,采用免疫组织化学法鉴定CALCA基因的蛋白表达水平变化。结果(1)成功地建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA片段的RNAi细胞模型,对目标基因(E7)表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。(2)选出CALCA基因启动子区富含CpG位点的目标片段,其大小为365碱基,含有19个CpG岛屿,发现其中13个CpG位点的胞嘧啶在SiHa细胞基因组DNA中发生了甲基化(13/19),而在表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型中,所有CpG位点的甲基化已发生逆转(0/19位点),同时RNAi干预后,CALCA基因的转录上调,蛋白质表达水平增高,证明该该目标片段的甲基化对HPV16-E7致癌蛋白表达存在依赖关系,而且甲基化对该基因表达产生了抑制效应。(3)临床标本研究显示,随着宫颈病变程度加重,CALCA蛋白表达水平呈现从强表达到弱表达缺失或表达缺失的改变,其宫颈炎、LSIL、HSIL和CSCC患者各组的CALCA蛋白“表达缺失率”分别为45.5% (15/33)、75% (12/16)、80.8% (21/26)和82.8% (24/29),与宫颈病变进程呈负相关(r=-0.361, P<0.01)。结论利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA基因启动子高甲基化对HPV16-E7致癌蛋白表达有依赖性,而其高甲基化水平与该基因表达水平变化密切关联。CALCA蛋白质表达缺失是维吾尔族妇女宫颈病变进程的重要标志,而其表达缺失的原因可能是该基因启动子高甲基化等表观遗传学修饰。