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葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3,Glucoamylases,GA),又称糖化酶,是制糖工业中的重要用酶。它可以水解淀粉或寡糖中的α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,最终产生葡萄糖。目前已知的葡萄糖淀粉酶分布在碳水化合物GH15家族和GH97家族,未见分布在GH57家族的葡萄糖淀粉酶。GH57家族的酶多来源自嗜热古菌和细菌,是一个嗜热酶汇聚的家族。本研究原本计划研究一个嗜热的II型普鲁兰糖酶,因此从GH57家族中进行了筛选,选择了来源于嗜热细菌Thermocrinis minervae的假定II型普鲁兰糖酶,命名为GA-Themi。GA-Themi的蛋白序列在Genebank数据库中最高相似性仅为40%,但是GA-Themi序列中含有GH57家族的特有保守氨基酸。委托生物公司合成该GA-Themi基因序列后,在E.coli中获得了可溶性的表达。对重组表达的GA-Themi蛋白进行纯化后,测定其对可溶性淀粉的比酶活为1.79 U/mg。最适pH为7.0,最适反应温度为90℃。GA-Themi的热稳定性很好,在70℃、80℃、90℃下的半衰期分别为2.5 h、2h、1.5 h。三种金属离子Mg2+、Co2+、和Ni+都能使GA-Themi的酶活提高2倍。以GA-Themi水解可溶性淀粉的酶活为100%,其对普鲁兰糖、支链淀粉和直链淀粉的酶活依次为76.5%、71.7%和64.2%。GA-Themi还能比较微弱的水解糖原和葡聚糖。这说明GA-Themi具有水解α-1,4和α-1,6糖苷键的能力。已知的II型普鲁兰糖酶对普鲁兰糖的水解能力要强于淀粉,而且对(a-1,6糖苷键的水解能力也远强于α-1,4糖苷键,因此Ⅱ型普鲁兰糖酶对普鲁兰糖的水解产物主要是三糖,会产生少量的葡萄糖和麦芽糖。但是GA-Themi水解普鲁兰糖只产生了葡萄糖,未见三糖。进一步验证GA-Themi水解淀粉的产物,发现也仅有葡萄糖,而且GA-Themi还可以直接水解麦芽糖为葡萄糖、水解麦芽三糖为葡萄糖。这些催化特点表明,GA-Themi不是II型普鲁兰糖酶,而是一个新型的葡萄糖淀粉酶。这是首次发现一个属于GH57家族的葡萄糖淀粉酶。与已知的GH15和GH97家族的葡萄糖淀粉酶相比较,GA-Themi的催化特点是对普鲁兰糖具有较高的水解能力,即具有更强水解α-1,6糖苷键的能力,同时热稳定性良好。这种特点使GA-Themi更适合应用在支链含量较高的糯米等淀粉的水解上。α-淀粉酶(EC3.2.1.1,Amylase,Amy)是一种能随机水解淀粉、普鲁兰糖等碳水化合物中的α-1,4糖苷键,产生麦芽低聚糖或麦芽糊精的水解酶。它也是制糖工业中的一种重要用酶。制糖工业中需要嗜热α-淀粉酶,但是目前商业中的高温α-淀粉酶和后续工艺中的酶的pH值不一致,实际应用中需要调节pH。为了寻找嗜热嗜酸的α-淀粉酶,本研究筛选了来源于嗜热泉古菌Acidilobus sp.7A的一个假定α-淀粉酶,命名为AmyAC。AmyAC的序列属于GH13家族,但是与GH13家族中可以形成独立的分支,与已知α-淀粉酶的蛋白序列相差较大,可能具有新的催化特性。委托生物公司合成该AmyAC基因序列后,在E.coli中获得了可溶性的表达。但是以可溶性淀粉、普鲁兰糖、糖原、支链淀粉、直链淀粉等为底物检查酶活,均未测到酶活。