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研究背景和目的外伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)是指因外部原因引起的脑功能或脑病理学的改变,是世界性的公共卫生问题。现有的针对TBI的治疗尚不能彻底恢复受损的神经功能。研究证实,成体脑内尚存在具有产生新生神经元功能的细胞。但是,从患者恢复的结果来看,这种内源性神经修复功能的效果是不足的。在过去的几十年里,干细胞替代治疗逐渐成为治疗神经系统损伤的热点,并且在世界范围内进行了广泛的研究。间充质干细胞(Mesenchymal Stromal Cell, MSC)由于其具有获取容易,且几乎存在于所有组织中,例如骨髓、脂肪组织、脐带、新生儿肝脏、肌肉及肺部等,并且容易体外扩增等特点,从而成为干细胞治疗的主力军[3-5]。目前已经有诸多动物实验证实MSC,对TBI、脑中风、神经退行性疾病等具有治疗作用[6-10]。目前认为MSC通过分泌一系列因子,达到促进神经发生(Neurogenesis)、血管发生(Angiogenesis),减轻细胞凋亡,控制炎症的目的。重复经颅磁刺激Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS),作为神经系统疾病的新的研究工具,近二十年慢慢用于临床。因其无创、简单易行、较好的定位性,无需进行大量临床前研究即可用于临床,因此广泛应用于临床多种神经系统疾病的诊断、治疗以及研究。大量临床研究证实TMS能够改善脑外伤患者的康复。TMS治疗脑外伤的机制虽然尚不完全清楚,但目前的观点认为主要通过对神经兴奋性的调控,表现为长时程增强(Long-term Potentiation, LTP)/长时程抑制(Long-term Depression, LTD)来发挥其治疗作用。一般认为高频rTMS能够诱导LTP,从而改善TBI后神经功能的恢复。目前尚无TMS联合MSC治疗TBI的研究,本研究将首次探索MSC脑内移植,联合rTMS干预治疗对TBI后大鼠脑内神经发生、损伤灶周边凋亡机制进行探索。方法成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,体重210-249g,利用Feeney自由落体法制作大鼠TBI模型。用改良神经功能严重程度评分(mNSS)评价大鼠造模术后第1、7、14及28天的行为学表现。根据POI评分,将大鼠分层随机分为①单纯损伤组；②损伤+TMS组；③损伤+hAD-MSC组；④损伤+TMS+hAD-MSC组。于术后第2天开始TMS,具体参数如下：放电电压700V,频率5Hz,第②、③组每只大鼠每日接受900个脉冲刺激。于术后第2天行hAD-MSC脑内植入术,第③、④大鼠各植入hAD-MSC5*105。分别在术后第7、14及28天三个时间点将大鼠分批处死,予生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌流后取脑,石蜡包埋切片,行HE和免疫组化染色。免疫组化指标：细胞增殖标记物BrdU,神经干细胞及祖细胞标记物musashil,成熟神经元标记物NeuN,细胞凋亡标记物caspase-3, hAD-MSC标志物抗人核单克隆抗体。部分大鼠在P02、P05和P013行18F-FDG micro-PET检查。结果1、P02开始,TMS干预组较无TMS干预组能够显著降低TBI后大鼠死亡率(two-way ANOVA, p=0.025); PO14起TMS有改善TBI后大鼠行为学评分的趋势(two-way ANOVA, p=0.104),表现为mNSS的降低。P028开始,TMS能够显著降低TBI后大鼠损伤侧脑实质的减少(two-way ANOVA, p=0.045)。PO13开始,TMS有提高TBI后大鼠损伤灶周边代谢的趋势(two-way ANOVA, p=0.075)。尚不能证明TMS具有促进TBI后大鼠内源性神经发生,以及抑制损伤灶周边细胞凋亡的作用。2、P02开始,MSC干预组较无MSC干预组能够降低TBI后大鼠死亡率,但无统计学差异(two-way ANOVA, p=0.800); PO14起MSC有改善TBI后大鼠行为学评分的趋势(two-way ANOVA, p=0.179),表现为mNSS的降低。P028开始,MSC有降低TBI后大鼠损伤侧脑实质的减少的趋势(two-way ANO VA,p=0.181)。PO13开始,MSC有提高TBI后大鼠损伤灶周边代谢的趋势(two-way ANOVA, p=0.136)。P028开始,MSC有显著促进TBI后大鼠SVZ区细胞增殖的作用,表现为BrdU+细胞计数较无MSC组的升高(two-way ANOVA, p=0.012),但Musashil染色并无显著差异。尚不能证明MSC具有促进TBI后大鼠内源性神经发生、以及抑制损伤灶周边细胞凋亡的作用。3、研究尚不能证明TMS与MSC之间在治疗TBI后大鼠上有相互协同或相互抑制的作用。4、抗人核单克隆抗体追踪植入TBI后大鼠脑内hAD-MSC结果显示,移植后28d仍有绝大多数大鼠可检测到存活hAD-MSC。存活的hAD-MSC几乎全部分布于梗死灶周边。结论1.脑内移植hAD-MSC具有显著提高SVZ区细胞增殖的作用,以及具有改善损伤灶周围脑代谢及减少TBI后脑实质的减少的趋势。尚不能证明hAD-MSC有降低损伤灶周边细胞凋亡的作用。2.TMS能够显著降低TBI大鼠的死亡率及TBI后脑实质的减少,并且有改善损伤灶周围脑代谢的趋势,这种作用可能与TMS改善损伤灶周围血供、降低炎症反应相关。该研究尚不能证明TMS有促进内源性神经发生、降低损伤灶周边细胞凋亡的作用。3. hAD-MSC*TMS二者之间没有显著的交互作用。4. hAD-MSC移植到脑内后几乎全部分布于损伤灶周边,至术后28天绝大多数大鼠仍可检测到hAD-MSC的存活。