研究背景：肺癌是目前全世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤之一,在我国随着工业化的进展和人们生活方式的转变,也成为发病率最高的恶性肿瘤之一。近年来在肺癌的治疗方面,尤其是化疗药物方面取得了长足的进步,但5年生存率仍不足15%。多数患者因为化疗耐药,而导致化疗效果不佳。顺铂是化疗的基石,因此研究顺铂耐药的机制以及克服顺铂耐药是很有前景的一个方向。Klotho(Kl)基因是由Kuro-o等在1997年研究自发性高血压时偶然发现的,后确认Klotho基因缺失鼠(K1-/-)的表型类似人类的衰老表现,包括寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损、软组织钙化、听力下降、骨质疏松。反之,Klotho基因高表达可延长实验动物的寿命,说明它是一个衰老抑制基因。当K1表达异常时,出现一系列与衰老及与衰老密切相关的疾病,提示Klotho基因在衰老和衰老相关疾病的发生中起着重要作用。近年来越来越多的研究显示k1基因还是一个肿瘤抑制基因。Wolf等采用组织芯片的方法,比较正常乳腺组织、早期浸润型导管癌及原位导管癌和相应癌旁组织中KL蛋白的表达情况,结果发现在所有正常乳腺组织中KL高表达,癌旁组织中的表达率为90%,而早期浸润型导管癌中表达率为22%,原位导管癌为17%。聚合酶链式反应(PCR)方法分析正常乳腺细胞与不同分化程度癌细胞中基因信使RNA水平,结果显示正常乳腺细胞与分化程度高的癌细胞中KL高表达,而分化程度低的细胞中KL低表达。进一步的实验发现KL抑制乳腺癌细胞的生长主要通过以下方式：抑制insulin/IGF-1信号通路的激活,上调激活FGF信号通路。乳腺癌细胞株MCF-7转染该基因后,可以抑制IGF-1受体酪氨酸的磷酸化,从而抑制信号下游IRS-1、AKT1、GSK3b等的磷酸化水平。综合以上关于KL基因的研究结果,以及我们在肺癌耐药株中发现耐顺铂的肺癌细胞株中KL基因表达降低。我们提出假设,老化是否影响顺铂化疗效果的一个因素；KL基因能否逆转肺癌对顺铂的耐药程度以及相关的信号通路的初步探索。本研究体外研究部分通过检测通过检测NSCLC顺铂耐药株A549DDP、 H460DDP及其亲本细胞株A549、H460的klotho的表达水平,扩展到多个肺癌细胞株中klotho表达水平与其顺铂IC50的相关性,了解klotho基因表达水平与肺癌耐顺铂的相关性；进一步过表达和沉默表达klotho基因后观察检测耐药株和亲本株细胞的顺铂敏感性水平变化,并探索其中相关信号通路PI3K/Akt的变化；体内实验中我们构建慢病毒载体,在裸鼠体内致瘤并观察klotho基因表达、PI3K/Akt信号通路、顺铂治疗敏感性之间的关系。确定klotho基因是否是顺铂化疗敏感性的一个有用指标。第一章klotho基因与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性研究目的探讨klotho基因表达是否与非小细胞肺癌顺铂耐药性相关；过表达和沉默表达klotho基因后肺癌细胞株对顺铂敏感性的变化；裸鼠体内探索klotho基因、PI3K/Akt信号通路和顺铂治疗敏感性的关系方法1.选用肺腺癌耐药细胞株A549DDP和H460DDP及其亲本细胞株A549和H460为研究对象,MTT法检测两对细胞株的顺铂敏感性(IC50), qRT-PCR和western blot检测klotho基因的表达水平,并分析不同细胞株中klotho表达水平和IC50两者相关性；2.构建过表达的klotho质粒,转染耐药肺腺癌A549DDP后,western blot检测PI3K/Akt信号通路的激活情况,DAPI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡变化3.ShRNA沉默表达klotho基因后,western blot检测PI3K/Akt信号通路的改变,Bax和bcl-2等凋亡相关蛋白的表达情况,DAPI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡的变化4.特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002阻断信号通路激活后,MTT法和western blot检测klotho基因的表达变化对耐药细胞的IC50和信号通路的激活的变化是否被阻断结果：1. A549DDP和H460DDP的顺铂的IC50分别为86.6±13.2uM和63.5±3.8uM,而其对应的亲本株分别为17.7±1.93uM和27.7±2.0uM。耐药株中klotho基因的表达水平下调约35%。同时用western blot检测了H1299,PC-9,H1650和MCF-7中的klotho蛋白表达水平以及相应的对顺铂的IC50值,统计学分析发现klotho的表达水平与IC50值负相关(R2=0.6556)。2. Western blot检测了耐药株A549DDP, H460DDP及其亲本株A549、H460中PI3K/Akt通路的激活状况,发现耐药株中Akt磷酸化水平明显高于亲本株(P<0.05)；而过表达klotho基因可以抑制PI3K/Akt信号通路的激活,表现为耐药株中磷酸化Akt表达水平下降,同时耐药株的IC50值较前下降(P<0.05)；高表达klotho基因后的肺癌细胞株DAPI染色检测凋亡的改变,结果发现凋亡较空载组明显增加(P<0.05)；流式细胞仪双染法测凋亡也发现凋亡增加,A549DDP中转染后凋亡增加47%,而H460DDP中增加了19.8%的凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和bcl-2结果与之前相同；western blot检测耐药相关基因ERCC1和P-gp的表达,发现ERCC1在高表达klotho的细胞中表达下调,而P-gp表达水平无变化。3.沉默表达klotho基因后我们由PCR结果挑选四条shRNA中sh-2序列,western blot检测klotho基因表达水平下降约50%,MTT检测耐药株A549DDP和H460DDP中IC50均有明显的升高,尤其A549DDP的IC50升至452.5+20.69uM; Western blot检测沉默表达的耐药株中磷酸化Akt和凋亡相关蛋白表达,发现Akt磷酸化水平明显升高(P<0.05),Bax表达降低而bcl-2表达升高；DAPI染色和流式细胞仪双染法测凋亡发现凋亡减少；4.在沉默表达klotho基因的耐药株中,分别用10uM和40uM浓度的特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002成功抑制Akt磷酸化后,MTT法检测细胞的IC50值,发现在两种抑制剂浓度下,A549DDP的IC50值分别为92.97±10.04和50.52±5.63；较之前452.5±20.69uM显著降低(P<0.01);DAPI染色凋亡检测、流式细胞仪双染测凋亡以及western blot检测凋亡相关蛋白Bax和bcl-2均发现klotho沉默表达引起的IC50增高和凋亡减少均被PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002所阻断；结论1. Klotho基因的表达水平是肺腺癌细胞对顺铂耐药的一个重要指标,该基因在敏感株中高表达,而在耐药株中表达减低；2. PI3K/Akt是klotho基因调节肺腺癌下游增殖凋亡改变的一个重要信号通路；阻断该通路后细胞凋亡受阻,癌细胞增加对顺铂的耐药；3. Klotho基因改变肺腺癌细胞对顺铂的耐药主要通过改变细胞的损伤修复和凋亡,而对P-gp等耐药蛋白的表达关系不密切。第二章klotho基因在体内对非小细胞肺癌(NSCLC)顺铂敏感性影响的研究目的：为进一步在裸鼠体内研究耐顺铂肺腺癌,构建含有klotho基因的shRNA序列的慢病毒颗粒,感染肺腺癌耐顺铂细胞株A549DDP和H460DDP后并在裸鼠皮下致瘤,体内研究瘤体对顺铂化疗的敏感性。方法：1.构建klotho基因的沉默表达shRNA,分别为sh-1、sh-2、sh-3、sh-4,并PCR验证检测沉默效率；2.构建效率高的慢病毒颗粒并感染肺腺癌耐药细胞株A549DDP和H460DDP,.筛选稳定表达株;3.裸鼠在皮下接种稳定感染细胞后,随机分组为2组,待肿瘤体积达到100mm3后,尾静脉按照顺铂(3.5mg/Kg,一周2次)。动态观察移植瘤生长情况及体积变化,计算肿瘤生长率,化疗后21天结束试验,western blot检测移植瘤中PI3K/Akt信号通路激活情况。结果：1.合成四条shRNA均对klotho基因表达有沉默作用,其中sh-2RNA沉默效率最高；2.成功构建klotho基因稳定沉默表达的A549DDP和H460DDP细胞株,并通过qRT-PCR结果验证,klotho基因表达下降约89%;3.裸鼠皮下致瘤后,分组给予顺铂治疗后,klotho基因沉默表达组移植瘤生长速度和体积均大于无关序列组(P<0.01)；Western blot结果显示在裸鼠体内klotho基因沉默后PI3K/Akt信号通路中磷酸化Akt水平升高,凋亡受阻。结论：shRNA构建的慢病毒颗粒可以稳定转染肺腺癌耐顺铂细胞株A549DDP和H460DDP,裸鼠体内移植瘤中沉默表达klotho基因的PI3K/Akt信号通路受到抑制,凋亡受阻。