背景子宫内膜癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,随着人口平均寿命的增加以及生活方式的转变,子宫内膜癌的发病率呈逐年上升和年轻化的趋势,在发达国家位于妇科恶性肿瘤首位。早期子宫内膜癌患者通过手术结合辅助治疗,预后较好。但是对于晚期和复发的子宫内膜癌患者,效果欠佳,5年生存率仅有10～20%。因此,需要一种新的有效的治疗方法。恶性肿瘤的发生、发展和转移过程与肿瘤微环境密切相关,肿瘤微环境中免疫细胞和分泌的细胞因子能够相互作用,共同决定肿瘤细胞在免疫反应中是被消灭还是完成免疫逃逸。研究发现,在子宫内膜癌肿瘤微环境中有大量的免疫细胞和细胞因子,能够激活内源性抗肿瘤免疫反应,参与子宫内膜癌的发生发展。肿瘤免疫治疗,特别是过继性细胞免疫治疗,是近年研究的热点。过继性细胞免疫治疗主要有树突细胞疗法、淋巴因子激活的杀伤细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞疗法和T细胞受体T细胞疗法等,但是这些过继性细胞免疫治疗各自均存在其局限性。γδT细胞是一类独特的先天性免疫细胞,不受主要组织相容性复合体的限制,在过继性细胞免疫治疗中逐渐受到关注。γδT细胞根据T细胞抗原受体δ链的不同,主要分为三大类:Vδ1、Vδ2和Vδ3亚型。Vδ1 T细胞主要分布在粘膜及肿瘤组织中,Vδ2T细胞主要分布在外周血中,Vδ3 T细胞主要分布在肝脏组织中。γδ T细胞能够感知肿瘤细胞的早期变化,激活后能够通过直接细胞毒性杀伤肿瘤细胞和分泌细胞因子促进免疫细胞活化,发挥抗肿瘤作用。有研究发现,γδT细胞在不同的肿瘤微环境中具有不同的免疫调节功能,在有些肿瘤组织中具有抗肿瘤作用,有些肿瘤组织中通过分泌IL-17A等细胞因子促进肿瘤的发展。在体外实验中,γδ T细胞对结直肠癌、膀胱癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和宫颈癌等多种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。临床试验结果显示,γδT细胞回输到肿瘤患者体内也具有一定的临床效果。但是γδ T细胞在子宫内膜癌患者外周血及肿瘤微环境中的分布及其作用、相关的过继性细胞免疫治疗的临床前和临床研究未见报道。目的通过检测子宫内膜癌患者外周血和癌组织中γδ T细胞及其亚型的分布比例,子宫内膜癌组织中分泌IL-17A的γδ T细胞比例及癌组织中γδ T细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤作用,探索γδ T细胞是否参与子宫内膜癌肿瘤微环境及其功能。通过建立体外扩增γδ T细胞的方法,扩增组织及外周血来源的γδ T细胞,检测γδ T细胞及联合卡铂对子宫内膜癌细胞的体外杀伤作用,为γδ T细胞用于子宫内膜癌的过继性细胞免疫治疗提供前期基础,从而为晚期或复发性子宫内膜癌探索出一条新的免疫治疗手段。方法一、γδ T细胞在子宫内膜癌患者肿瘤微环境中的分布及功能1.收集21例子宫内膜癌患者外周血和15例同龄女性外周血做对照组,使用Ficoll-Paque分离液分离,获取外周血单个核细胞,流式细胞术检测外周血中γδT细胞及其亚型的比例。2.收集22例新鲜子宫内膜癌组织和12例正常子宫内膜组织,将组织标本剪碎,组织消化液消化3 h,使用70μm的滤网获得细胞悬液,培养2～3天,去除贴壁细胞,孵育抗体,流式细胞术检测组织中γδ T细胞和各亚型的比例及分泌IL-17A的γδ T细胞比例。3.使用两种不同抗体包被法联合IL-2扩增子宫内膜癌组织来源的γδ T细胞。14天后,计数细胞数量和细胞扩增倍数,流式细胞术检测扩增γδ T细胞的纯度及其亚型比例,比较两种抗体扩增的细胞数量、γδ T细胞的扩增倍数和纯度。4.将子宫内膜癌组织来源的γδT细胞与子宫内膜癌HEC-1A细胞和Ishikawa细胞按不同效靶比共培养,通过CCK-8法检测细胞的存活率,评估扩增后γδ T细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤作用。二、外周血来源的γδ T细胞对子宫内膜癌细胞的体外杀伤作用1.通过anti-γδ抗体包被法联合IL-2扩增子宫内膜癌患者、同龄对照女性和健康年轻女性外周血来源的γδT细胞。扩增14天后,计数细胞数量和扩增倍数,流式细胞术检测三组外周血来源的γδ T细胞扩增的纯度及亚型的比例。2.将扩增的三组γδ T细胞分别与子宫内膜癌HEC-1A细胞和Ishikawa细胞按不同效靶比共培养,CCK-8法分别检测细胞的存活率,ELISA检测细胞培养上清液中IFN-γ的表达量,评估并比较扩增后三组γδ T细胞对HEC-1A细胞和Ishikawa细胞的杀伤作用。3.使用不同浓度卡铂分别作用于HEC-1A细胞和Ishikawa细胞,通过计数活细胞的数量和CCK-8检测细胞的存活率,确定合适的浓度和时间。选择健康年轻女性来源的γδ T细胞与卡铂预处理子宫内膜癌细胞共培养,使用CCK-8法分别检测细胞的存活率,评估健康年轻女性来源的γδ T细胞对卡铂预处理子宫内膜癌细胞的杀伤作用。结果一、γδ T细胞在子宫内膜癌患者肿瘤微环境中的分布及功能1.外周血γδ T细胞及其亚型分布:流式细胞术结果显示子宫内膜癌患者外周血中的γδ T细胞及其亚型Vδ1 T细胞和Vδ2T细胞的百分比与同龄对照组相比无明显差异（P＞0.05）,外周血中均以Vδ2 T细胞亚型为主。2.组织中γδ T细胞及亚型比例和分泌IL-17A的γδ T细胞的比例分布:流式细胞术结果显示子宫内膜癌组织中的γδ T细胞及Vδ1 T细胞的比例高于正常子宫内膜组织（P＜0.05）;两组中Vδ2 T细胞的比例较低,无明显差异（P＞0.05）。同时,两组中分泌IL-17A的γδ T细胞的比例均很低,无明显差异（P＞0.05）。3.不同抗体扩增子宫内膜癌组织来源的γδ T细胞的纯度及各亚型比例:anti-Vδ1抗体扩增γδT细胞的扩增倍数要高于anti-γδ抗体的（P＜0.05）;流式细胞术结果显示,虽然两者扩增的γδ T细胞纯度无明显差异P＞0.05),但anti-Vδ1抗体扩增的Vδ1 T细胞较高（P＜0.05）,而Vδ2 T细胞的比例较低（P＜0.05）。因此,选择anti-Vδ1抗体扩增癌组织的γδ T细胞用于后续的杀伤实验。4.癌组织来源的γδT细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤作用:通过CCK-8法检测不同效靶比中细胞的存活率,在效靶比0 vs 1:1和20:1 vs 40:1时HEC-1A细胞的存活率差异具有统计学意义（P＜0.05）;在效靶比为1:1 vs 5:1 vs 10:1 vs 20:1 vs 40:1时Ishikawa细胞的存活率差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明子宫内膜癌组织来源的γδ T细胞对子宫内膜癌细胞具有杀伤作用,且杀伤作用随着效靶比的增加逐渐增强。二、外周血来源的γδ T细胞对子宫内膜癌细胞的体外杀伤作用1.外周血来源的γδ T细胞的扩增情况:使用anti-yδ抗体包被法联合IL-2扩增外周血中的γδ T细胞,健康年轻组γδ T细胞扩增的数量、倍数和纯度均高于子宫内膜癌组和同龄对照组（P＜0.05）,而子宫内膜癌组和同龄对照组之间没有明显差异（P＞0.05）。外周血中扩增后的γδ T细胞以Vδ2亚型为主,Vδ2 T细胞在健康年轻组中的比例最高,达到94.23±0.77%。2.外周血来源的γδ T细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤作用:三组扩增的γδT细胞与子宫内膜癌HEC-1A细胞和Ishikawa细胞按不同效靶比共培养,通过CCK-8法检测细胞的存活率。三组中各效靶比间细胞存活率均有显著差异,说明三组中γδ T细胞对子宫内膜癌细胞均具有杀伤作用,且杀伤效率随着效靶比的增加逐渐增强。与子宫内膜癌组和同龄对照组相比较,健康年轻女性来源的γδ T细胞的杀伤作用最强,差异均具有统计学意义。三组细胞共培养上清液中的IFN-y随着效靶比的增加逐渐升高,各效靶比之间差异均有统计学意义;与子宫内膜癌组和同龄对照组相比,健康年轻组IFN-γ的表达量最高。3.健康年轻女性来源的γδ T细胞联合卡铂对子宫内膜癌细胞的杀伤作用:通过计数存活细胞的数量和CCK-8实验选取细胞存活率为80%时卡铂浓度HEC-1A为80 μg/ml、Ishikawa为20μg/ml。γδ T细胞与卡铂预处理72 h的子宫内膜癌细胞共培养24 h,通过CCK-8检测γδ T细胞组、卡铂组和γδ T细胞联合卡铂组中的细胞存活率,γδ T细胞联合卡铂中子宫内膜癌细胞的存活率明显低于单独使用γδ T细胞和单独使用卡铂时的,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论1.γδT细胞参与了子宫内膜癌肿瘤微环境,且在子宫内膜癌肿瘤微环境中可能不发挥促肿瘤作用,而可能具有杀伤肿瘤细胞的作用。2.anti-Vδ1抗体包被法联合IL-2成功建立了子宫内膜癌组织γδ T细胞的体外扩增方法,但是扩增的γδ T细胞纯度较低;采用anti-γδ抗体包被法联合IL-2建立了外周血中的γδ T细胞的体外扩增方法,扩增的γδ T细胞纯度较高。3.外周血来源的γδ T细胞对子宫内膜癌细胞具有杀伤作用。健康年轻女性外周血来源的γδ T细胞的数量和纯度最高、杀伤作用最强,具有应用于同种异体过继性细胞免疫治疗的潜力。4.γδ T细胞联合卡铂对子宫内膜癌细胞的杀伤作用更强,可能作为应用于子宫内膜癌过继性细胞免疫治疗的一种方案。