第一部分噬菌体病毒样颗粒的制备及改建目的：我们已成功构建了直径约30nm的Qp-2aa噬菌体病毒样颗粒(Qp-2aa VLP),降压疫苗强调对Th2型体液免疫应答的诱导,20-200nm范围内更大直径的载体可能更利于诱导2型免疫应答；VLP具有良好的内部包裹呈递能力。为了增强降压疫苗的免疫效应,对更大直径VLP的构建及小直径VLP的改装就显得十分必要。本研究将探索性地构建66nm的HK97VLP及其嵌合体,同时研究30nm的AP205VLP对具有免疫刺激或免疫抑制作用的寡聚脱氧核苷酸(ODN)的包裹及其效应。方法：使用全基因合成技术合成HK97噬菌体衣壳蛋白基因(GP4和GP5)并予以扩增,构建双表达质粒pETDuet-HK97, IPTG诱导gp4和gp5蛋白同时表达并进行自我组装,利用层析技术纯化HK97VLP,体外酸化诱导其成熟,SDS-PAGE判断其成熟度及纯度,在透射电镜下观测其形态大小；全基因合成GP5’基因,构建嵌合体表达质粒pETDuet-HK97-P,用相同技术方案制备嵌合体HK97-P VLP;制备HK97VLP载体疫苗,免疫SD大鼠,与嵌合体疫苗比较对抗体产生的辅助能力。合成AP205VLP衣壳蛋白(CP)基因,构建其表达质粒pET28-AP205, IPTG诱导CP表达及其自我组装,纯化AP205VLP, SDS-PAGE判断其纯度,并在透射电镜下观测其形态大小；将CpG ODN2006及ODNA151包裹进AP205VLP内部,验证其包裹体对脾脏单个核细胞的刺激或抑制效应。结果：成功构建HK97VLP野生型双表达质粒pETDuet-HK97和嵌合体双表达质粒pETDuet-HK97-P,均能进行自我组装成HK97VLP前体,电镜鉴定其直径为54nm;体外对前体进行酸化成熟诱导,前体成功膨胀交联成成熟体HK97VLP,电镜鉴定直径为66nm；野生型耦联疫苗与嵌合体疫苗均能强效辅助抗肽抗体的产生,并且前者稍强于后者。质粒pET28-AP205表达AP205VLP成功,SDS-PAGE电泳判断其分子量正确,予以分离纯化后电镜下鉴定为自行组装的球形颗粒,直径约30nm;包裹CpG ODN2006的AP205VLP包裹体能直接刺激脾脏单个核细胞y-IFN的生成,包裹ODNA151的AP205VLP则显著抑制LPS诱导的脾脏单个核细胞γ-IFN的生成。结论：成功地构建了直径66nm的HK97VLP和直径30nm的AP205VLP,并成功地完成了HK97VLP嵌合体的构建及对AP205VLP内部的包裹改装,提供了更适合更全面的生物靶向治疗载体及新型的ODN投递方式。第二部分治疗性肾素降压疫苗的研究目的：肾素作为RAS系统启动的关键酶分子,在高血压的发生发展中发挥着重要的作用,是理想的降压疫苗靶点之一。本研究将设计出数段针对肾素的短肽,筛选出具有降压作用的疫苗,从而发明一段或数段针对高血压的肾素短肽疫苗。方法：根据人肾素晶体衍射结构,采用生物信息学方法,按照以下方案：1)序列氨基酸必须包括肾素催化位点(Asp32和Asp215)之一或"flap"段序列；2)与人类蛋白质组进行相似性比对,选择相似性低的序列；3)进行亲水性及抗原性预测,选择亲水性及抗原性均较好的肽段；4)氨基酸数目不超过10个。在预实验基础上,我们设计了6段短肽序列(rR32、rR72、rR215、hR32、hR72和hR215)作为可能的B细胞表位,用以发展肾素疫苗。将6段短肽与匙孔血蓝素蛋白耦联制备疫苗,免疫正常SpragueDawley (SD)大鼠,观测各肽段的抗体产生及滴度变化趋势,应用鼠尾血压计测量大鼠血压变化,放射免疫分析法(PIA)测定血浆RAS变化状况。实验结束后取血并纯化各肽段抗体,检测各抗体与人肾素的结合能力及对血浆肾素活性(PRA)的影响。将筛选出的有效短肽疫苗免疫自发性高血压大鼠(SHRs),观测其血压、抗体滴度及RAS的变化状况,检测肾脏有无免疫性损害；同时免疫京都Wistar大鼠(WKY),评价疫苗的初步安全性。结果：所有肽段均能产生相应的高滴度抗体,在63天时,SD大鼠的抗血清滴度范围在1：32,000至1：80,000之间。所有抗血清在体外均可以与人肾素相结合。与对照抗血清及对照抗体相比,rR32、hR32、rR72和hR72肽段组抗血清和纯化后抗体均显著降低PRA(减少50%以上)。ELISA实验证明抗rR32和抗hR32抗体有着良好的交叉反应性,而抗rR72和抗hR72抗体间交叉性很低。rR32和hR32表位疫苗对SD大鼠的血压无明显影响,但是显著降低SHRs的收缩压,最高降幅达到15mmHg (175±2vesus190±3mmHg, P=0.035;180±2vesus195±3mmHg, P=0.039)±免疫组SHRs和WKY大鼠肾脏均未发现明显的免疫性损害。结论：我们率先研制出了一种基于人肾素Asp32催化位点序列的hR32短肽疫苗。hR32短肽疫苗可抑制人肾素活性,显著降低SHRs血压,且在动物体内是初步安全的。该疫苗的研究为高血压的治疗提供了新思路和新方法。第三部分ATRQβ-001降压疫苗的机制研究目的：前期工作中,我们将人血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)胞外第二环的靶点短肽ATR-001与Qβ-2aaVLP载体进行耦联,成功制备出ATRQβ-001疫苗,该疫苗能够显著降低SHRs的血压并具有良好的靶器官保护效应,但是其确切的降压及靶器官保护作用机制仍未明了。本研究将探讨ATRQβ-001疫苗的降压及靶器官保护机制。方法：体内试验中,将ATRQP-001疫苗免疫SHRs和Ang Ⅱ诱导的Balb/c高血压小鼠：通过鼠尾血压计及无线遥测技术观测血压；酶联免疫吸附试验测定抗体滴度变化情况；应用心脏超声及病理技术观测疫苗对模型动物鼠心肌肥厚及纤维化的影响状况；应用放射免疫分析法(RIA)测定SHRs血浆RAS的变化情况及心脏和肾脏中AngⅡ的含量；通过qRT-PCR和免疫印迹分析法(WB)分别检测SHRs心脏和肾脏中肾素和AT1R的mRNA、蛋白表达水平。体外实验中,使用细胞免疫荧光技术(IF)及RIA检测抗ATR-001抗体与AT1R的结合能力及抗ATR-001抗体与AngⅡ竞争结合AT1R的能力；通过WB检测抗ATR-001抗体对肠系膜动脉血管平滑肌(SASMCs)及稳定过表达AT1R HEK293细胞系的ERK1/2磷酸化水平的影响；IF检测抗ATR-001抗体对AngⅡ导致的PKC-α转位的影响及共聚焦显微镜分析对AngⅡ引起的钙内流升高的影响。结果：ATRQβ-001疫苗能够有效降低SHRs血压,最高降幅达到19mmHg(173±2vesus192±3mmHg, P=0.003);降低AngⅡ诱导的高血压小鼠血压,最高降幅达到35mmHg (143±4vesus178±6mmHg, P=0.005),同时,ATRQβ-001疫苗能够显著减轻高血压导致的心肌肥厚和纤维化损伤,具有显著的靶器官保护作用。与缬沙坦组导致的RAS激活不同,ATRQβ-001疫苗对SHRs血浆RAS无明显影响,未见RAS的反馈激活,左室心肌和肾脏皮质Ang Ⅱ的浓度三组中均未检测到明显差异。ATRQβ-001疫苗亦显著降低心脏和肾脏中AT1RmRNA和蛋白表达水平。缬沙坦显著增加肾脏肾素的mRNA表达水平,而ATRQβ-001疫苗对其表达未有明显影响。体外实验中,抗ATR-001抗体能够与SASMCs及稳定过表达AT1R HEK293细胞系上AT1R结合,不与AngⅡ竞争结合AT1R。但是,抗ATR-001抗体显著抑制AngⅡ刺激引起的SASMCs及稳定过表达AT1R HEK293细胞系ERKl/2磷酸化水平(72%降低,P=0.013),显著抑制AngⅡ刺激导致的PKC-α转位及胞内钙内流的升高。结论：ATRQβ-001疫苗通过削弱压力反应和抑制AngⅡ激动性信号通路发挥降低SHRs和Ang Ⅱ诱导的高血压小鼠血压的作用。ATRQp-001疫苗不引起循环和局部RAS的反馈激活,但是可能抑制ATlR内化并促进其降解,显示出对AT1R的调节作用,从而相比于ARB类药物,发挥出更佳的靶器官保护作用。