抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs),是一类能够降低溶液冰点、修饰冰晶形态、抑制冰晶重结晶的蛋白质。独特的性质使其在冷冻食品添加剂领域具有较好的应用前景。本文以冷诱导大麦籽粒为原料,采用渗透-离心法提取大麦籽粒AFPs,经纯化鉴定后对得到的Ba AFP-1性质进行预测与分析;将Ba AFP-1添加到面团及湿面筋蛋白中,研究其在冷冻及冻融循环过程中对面团及湿面筋蛋白热力学特性、水分状态及其他理化特性的影响,探索其对冷冻面制品品质的影响机制;最后通过分子模拟技术,构建Ba AFP-1三维结构模型,与冰晶面进行对接,通过分子动力学计算,确定冰晶结合位点,解释其抗冻机理。论文首先对渗透-离心法提取大麦籽粒蛋白质中提取缓冲液的种类、料液比、p H、离子强度及渗透时间进行了优化,接着对提取液的光谱学特性、分子量分布、热滞活性进行了分析,并对提取液进行了一系列纯化处理,最后对获得的AFPs进行了纯度及活性鉴定。结果表明,大麦籽粒AFPs的最佳提取条件为:提取缓冲液为Na2HPO4-Na H2PO4缓冲液(50m M,p H7.6,0.05M Na Cl),料液比为1:5,真空渗透10h;采用真空渗透法提取得到的AFPs粗提液组成简单,且热滞活性高;冷诱导大麦籽粒中有AFPs,且AFPs仅在冷诱导之后的大麦籽粒中存在;经纯化后得到电泳纯的Ba AFP-1,热滞活性为1.04°C。对纯化的到的Ba AFP-1的相对分子质量进行了测定,通过MALDI-TOF–MS/MS法对其序列进行了鉴定,并对其氨基酸组成及同源性进行了分析;以Ba AFP-1序列为基础,对其等电点、相对分子质量、二级结构及溶剂可接触性等理化特性进行了预测,并对其光谱特性、二级结构组成及亲疏水性进行了测定,同时还对冰晶含量对其活性的影响及最大有效活性浓度进行了研究。结果表明:Ba AFP-1相对分子质量为13370Da,其氨基酸序列为SGPWMWCDPE MGHKVSPLTRCRALVKLECV GNRVPEDVLR DCCQEVANIS NEWCRCGDLG SMLRSVYAAL GVGGGPEEVF PGCQKDVMKL LVAGVPALCN VPIPNEAAGT RGVCYWSAST DT,与Alpha amylase inhibitor BDAI-1具有较大的相似性;与禾本科小麦族12个属中的蛋白具有较高同源性,均具有抗菌、抗虫特性,与小麦属中病程相关蛋白匹配率最高,与大米、拟南芥中AFPs同源性较低。Ba AFP-1理论等电点为5.04,分子量为13101.11,二级结构中富含α-螺旋,且氨基酸残基具有较高的溶剂可及性;特征波长为280nm,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,为非糖蛋白,最大有效活性浓度为20mg/m L,冰晶含量对THA有显著影响,具有较强亲水性和较弱表面疏水性,热变性温度为65.60°C。将Ba AFP-1添加到面团中,研究了冷冻及冻融循环过程中Ba AFP-1对面团热力学性质、水分状态及流变学性质、微观性质、发酵流变学性质、烘焙特性及面包品质影响。结果表明,对新鲜面团,Ba AFP-1能够影响表观潜热;影响面团冻结过程中的过冷现象,提高熔融温度,增大熔融区间,提高玻璃化转变温度,降低熔融焓从而降低可冻结水含量;在冻融循环过程中,Ba AFP-1是通过影响冻融循环过程中熔融温度向高温区移动,减缓可冻结水含量的增加,即影响温度波动引起的冰晶的重结晶来实现对面团结构的保护的;Ba AFP-1能够减少冻藏过程中的干耗,降低面团中水分流动性,减缓冻藏过程中面团水分流动性的转变以及水分从内部向表面的迁移实现的;Ba AFP-1能够降低冷冻及冻藏对面团弹性模量及黏性模量的破坏,保护面团面筋网络;它还能降低冷冻及冻藏对酵母产气能力及面团面筋网络和持气能力的破坏来提高面团烘焙特性。将Ba AFP-1添加到湿面筋蛋白中,研究了冷冻及冻融循环过程中Ba AFP-1对湿面筋蛋白热力学性质、水分状态及流变学性质、微观性质、SDS-可溶性蛋白组成、二级结构、表面疏水性的影响。结果表明,湿面筋蛋白与面团中表观潜热变化规律一致,冻结过程中湿面筋体系均表现出显著的过冷现象;与在面团中的作用不同,Ba AFP-1是通过降低冻结温度实现对湿面筋蛋白体系的冷冻保护作用的,Ba AFP-1能够降低湿面筋蛋白的熔融焓与可冻结水含量,提高玻璃化转变温度;冻融循环处理破坏了湿面筋蛋白中毛细管束缚水,水分含量均降低但幅度较小;Ba AFP-1的加入能影响水分流动性,减弱了冻融循环处理对水分流动性的影响;冻融循环过程中湿面筋蛋白中表面水分迁移现象不如面团中明显,但Ba AFP-1的加入能够抑制冰晶的重结晶作用,从而影响湿面筋蛋白内部的水分分布。添加Ba AFP-1能减缓冻融循环处理后样品弹性模量与黏性模量的下降;通过影响冻结过程中面筋蛋白中冰晶的大小和形状,抑制冻融循环过程中的重结晶作用,保护湿面筋蛋白微观结构;冻结处理和冻融循环前期,Ba AFP-1对SDS-可溶性蛋白分子量分布影响不大,后期能够减缓冻融循环过程对面筋蛋白聚合度的破坏作用;能够保护面筋蛋白α-螺旋结构免受冰晶的破坏,同时还能够增大蛋白的分子内与分子间氢键作用,在冻融循环过程中能够增大面筋蛋白的分子内氢键作用,同时通过能够促使被破坏的分子间氢键的再次形成,使面筋蛋白二级结构保持相对稳定状态,从而减少因网络结构破坏造成的疏水性残基的暴露,减缓疏水性指数的下降。对Ba AFP-1的三维结构进行同源建模,并将获得的三维结构与冰晶进行对接和分子动力学模拟,以确定最佳冰晶结合表面与结合机制。1HSS被认为是Ba AFP-1的最佳同源建模模板,序列覆盖率为0.89,E值为9e-28,二者序列匹配率为50%;以1HSS为模板同源建模,经优化后所得模型结构合理且具有较高的准确性;将Ba AFP-1以不同角度与不同晶型的冰晶面进行对接,对每个对接体系的能量最低构象进行相互作用的分析。结果表明αX和其两侧的loop构成的平面与冰晶面形成相互作用,该平面可能在结合冰晶的过程中扮演重要的作用,除Thr外,Glu和Asn也参与了和冰面的结合;分子动力学模拟的结果表明,Ba AFP-1与三种典型的冰晶面均可以产生有效的结合构象,其结合是通过氢键和疏水相互作用共同实现的。Ba AFP-1可能与Prism型晶面具有最强的结合能力,而这种决定结合强度的关键因素在于氢键相互作用。Ba AFP-1与secondary-prism型晶面的结合区域上的高柔性残基可能不利于两者的结合。