近年来,临床及实验室研究均证明能量代谢能够影响心肌重构及心衰的病理生理过程,最显著的变化是心肌脂肪酸利用率的下降伴随葡萄糖氧化利用的上升,最终将导致能量供需不平衡以及线粒体功能失调3。心衰心肌长期维持这种低效率的能量代谢模式会导致ATP生成受损,并且阻碍化学能量向机械能量的转化,最终结果是不可逆的心力衰竭。最近实验研究证实腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂AICAR和metformin能够逆转心脏重构,其机制是通过保持AMPK的活性从而保证心肌ATP供应水平6。这些证据提示我们改善心肌能量供应模式的策略可能是未来治疗心衰的有效方向。然而,在心衰晚期,调控或改善已经发生偏移的代谢模式是非常困难的,因此寻找一个能在疾病早期预测代谢模式变化,甚至早期调控或维持能量代谢模式的分子就更为重要也更可行。线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2),作为线粒体内的关键酶,已经在多种心肌损伤过程中被证实是心肌内源性保护因子,包括内质网应激、缺血再灌、心肌梗死及糖尿病心肌病等。ALDH2的经典功能是处理能量底物氧化过程中的副产物-毒性醛类,例如4-羟壬烯醛等。最近,Jin等报道ALDH2缺失可促进心肌葡萄糖利用同时导致代谢重构,同时Ren等也报道AMPK的磷酸化水平受ALDH2调控8。因此ALDH2的作用已经逐步扩展至能量代谢领域。至今,ALDH2对成年心脏主要能量底物,即脂肪酸及葡萄糖代谢的影响还没有被完全揭示。我们基于前期研究的证据推测ALDH2可能通过AMPK及其他能量通路发挥调控能量代谢模式的作用,而非仅限于处理代谢垃圾。在东亚人群中ALDH2缺失型分布较普遍,而这种缺失在西方人群中很少见。如果其能够影响能量代谢进而参与心衰的病理生理过程,我们的研究可能提供基于不同ALDH2基因型的更适应东亚特别是中国人群特征的预警或保护手段。在本研究中我们通过对ALDH2敲除小鼠进行压力超负荷刺激,诱导心衰后进行功能学、形态学、能量模式及能量信号通路四个层面的研究,证实了ALDH2通过调控心肌脂肪酸和葡萄糖代谢平衡,参与心衰的发生和发展过程,其分子机制可能是通过对AMPK/PPARa--mCPT-I通路而实现的。第一部分乙醛脱氢酶2对压力超负荷小鼠心功能影响的研究目的：利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,并观察压力超负荷对ALDH2敲除(ALDH2-/=)及野生型(WT)小鼠心脏功能影响的差异。方法：取8-10周龄WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠,利用主动脉弓缩窄(TAC)构建压力超负荷模型,并依照TAC不同时长随机分为4组：TAC-对照组(Sham),TAC-2周,TAC-4周及TAC-8周。经胸行心脏超声检查,观察EF和FS值。选取两基因型心功能差异最大的时间点作为后续实验的基础。时间点(TAC-4周)选取后,超声检查EF、FS、左室壁厚度及内径；经颈动脉测压检查左室内压及主动脉压。结果：本部分研究发现,ALDH2-/-及WT小鼠基础状态无显著差异；TAC后ALDH2-/-心功能下降更快,心室重构更显著,特别是在术后4周两基因型小鼠心功能差异最大,因此选择此时间点为后续实验基础；TAC4周后ALDH2-/-小鼠EF、FS均下降,IVS；d、LVPW；d均增厚,LVESD扩大,证实心功能恶化较野生小鼠更重；血流动力学检测发现ALDH2-/-在TAC后LVESP升高而LVEDP无明显差异,主动脉血压在基因型之间无显著差异。结论：本部分研究成功利用主动脉弓缩窄方法在ALDH2-/-小鼠体内构建压力超负荷模型。成功选择心功能差异最大的术后4周作为后续实验提供时间基础。证实ALDH2-/-可促进压力超负荷引起心功能失代偿。对ALDH2敲除(ALDH2-/=)及野生型(WT)小鼠心脏功能影响的差异。方法：取8-10周龄WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠,利用主动脉弓缩窄(TAC)构建压力超负荷模型,并依照TAC不同时长随机分为4组：TAC-对照组(Sham),TAC-2周,TAC-4周及TAC-8周。经胸行心脏超声检查,观察EF和FS值。选取两基因型心功能差异最大的时间点作为后续实验的基础。时间点(TAC-4周)选取后,超声检查EF、FS、左室壁厚度及内径；经颈动脉测压检查左室内压及主动脉压。结果：本部分研究发现,ALDH2-/-及WT小鼠基础状态无显著差异；TAC后ALDH2-/-心功能下降更快,心室重构更显著,特别是在术后4周两基因型小鼠心功能差异最大,因此选择此时间点为后续实验基础；TAC4周后ALDH2-/-小鼠EF、FS均下降,IVS；d、LVPW；d均增厚,LVESD扩大,证实心功能恶化较野生小鼠更重；血流动力学检测发现ALDH2-/-在TAC后LVESP升高而LVEDP无明显差异,主动脉血压在基因型之间无显著差异。结论：本部分研究成功利用主动脉弓缩窄方法在ALDH2-/-小鼠体内构建压力超负荷模型。成功选择心功能差异最大的术后4周作为后续实验提供时间基础。证实ALDH2-/-可促进压力超负荷引起心功能失代偿。第二部分乙醛脱氢酶2对压力超负荷小鼠心肌细胞形态影响的研究目的：利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,观察压力超负荷对ALDH2-/-及WT小鼠心肌重构、心肌细胞及亚细胞器形态的影响。方法：取8-10周龄WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠,利用TAC构建压力超负荷模型。TAC-4周后取材,称量体重、心脏重量及湿肺重量,拍照后固定行HE、MASSON染色,观察心肌重构、心肌细胞肥大及纤维化情况。利用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,利用电镜观察心肌细胞器,包括线粒体和肌纤维形态。结果：本部分研究发现,TAC术后4周,ALDH2-/-小鼠心脏明显增大、增重,伴随肺水肿的出现；左室中段横截面积增大,提示心室壁增厚,心腔扩张；HE染色示心肌细胞肥大伴随致密度下降和空泡化出现；MASSON染色示纤维化较WT小鼠轻；TUNEL示心肌细胞凋亡加重；电镜示线粒体结构受损严重伴随心肌纤维断裂。结论：本部分研究通过心脏大体、组织、细胞及亚细胞器水平的形态学观察,证实ALDH2-/-可促进压力超负荷可引起心肌重构、心肌细胞肥大、凋亡和亚细胞器的损伤,从而加重功能的失代偿。第三部分乙醛脱氢酶2对压力超负荷小鼠心肌能量代谢模式影响的研究目的：利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,观察压力超负荷对ALDH2-/-及WT小鼠脂肪酸、葡萄糖代谢率和ATP含量的影响。方法：取8-10周龄WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠,利用TAC构建压力超负荷模型,TAC-4周后取材。同时利用ALDH2干扰的原代心肌细胞构建细胞牵张模型,牵张12h后收集。利用液相色谱联合质谱技术检测不同长度脂酰辅酶A和脂酰肉碱绝对含量及二者比值,以反应脂肪酸代谢水平。利用PET-CT扫描18F-FDG和γ计数,探测心肌葡萄糖摄取率。利用荧光素酶技术检测心肌及原代心肌细胞内ATP含量。结果：本部分研究发现,ALDH2-/-小鼠基础状态心肌组织内脂酰辅酶A储积但脂酰肉碱含量明显较少,TAC术后4周脂酰辅酶A和脂酰肉碱含量同时下降,提示ALDH2-/-抑制脂肪酸向线粒体内转运,压力超负荷则整体抑制脂肪酸的利用水平；ALDH2-/-小鼠基础状态心肌葡萄糖摄取率与WT无明显差异,且在压力超负荷刺激后ALDH2-/-组明显升高；ATP在非手术ALDH2-/-小鼠心肌中显著下降,压力超负荷后进一步下降。细胞水平结果与心肌组织结果相同。结论：本部分研究通过脂酰辅酶A、脂酰肉碱及18F-FDG等能量底物摄取利用率水平的观察,证实ALDH2-/-可促进压力超负荷可引起脂肪酸利用率下降及葡萄糖利用率上升,即能量代谢模式的重构,同时导致ATP含量的减少,从而促进心肌功能的恶化。第三部分乙醛脱氢酶2对压力超负荷小鼠心肌能量代谢模式影响的研究目的：利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,观察压力超负荷对ALDH2-/-及WT小鼠脂肪酸、葡萄糖代谢率和ATP含量的影响。方法：取8-10周龄WT及ALDH2-/-雄性健康成年鼠,利用TAC构建压力超负荷模型,TAC-4周后取材。同时利用ALDH2干扰的原代心肌细胞构建细胞牵张模型,牵张12h后收集。利用液相色谱联合质谱技术检测不同长度脂酰辅酶A和脂酰肉碱绝对含量及二者比值,以反应脂肪酸代谢水平。利用PET-CT扫描18F-FDG和γ计数,探测心肌葡萄糖摄取率。利用荧光素酶技术检测心肌及原代心肌细胞内ATP含量。结果：本部分研究发现,ALDH2-/-小鼠基础状态心肌组织内脂酰辅酶A储积但脂酰肉碱含量明显较少,TAC术后4周脂酰辅酶A和脂酰肉碱含量同时下降,提示ALDH2-/-抑制脂肪酸向线粒体内转运,压力超负荷则整体抑制脂肪酸的利用水平；ALDH2-/-小鼠基础状态心肌葡萄糖摄取率与WT无明显差异,且在压力超负荷刺激后ALDH2-/-组明显升高；ATP在非手术ALDH2-/-小鼠心肌中显著下降,压力超负荷后进一步下降。细胞水平结果与心肌组织结果相同。结论：本部分研究通过脂酰辅酶A、脂酰肉碱及18F-FDG等能量底物摄取利用率水平的观察,证实ALDH2-/-可促进压力超负荷可引起脂肪酸利用率下降及葡萄糖利用率上升,即能量代谢模式的重构,同时导致ATP含量的减少,从而促进心肌功能的恶化。第四部分乙醛脱氢酶2对压力超负荷小鼠心肌能量代谢影响的分子机制研究目的：利用主动脉弓缩窄方法构建压力超负荷小鼠模型,观察压力超负荷对ALDH2-/-及WT小鼠能量代谢通路关键分子表达的影响。方法：取8一10周龄WT及ALDH2-／-雄性健康成年鼠,利用TAC构建压力超负荷模型,TAC-4周后取材。同时利用ALDH2干扰的原代心肌细胞构建细胞牵张模型,牵张12h后收集。利用western-blot检测心肌及原代细胞内能量代谢总控分子AMPK, p-AMPK及PPARa的蛋白表达水平；同时利用real-time PCR检测下游脂肪酸代谢mCPT-I及葡萄糖代谢PDH的mRNA水平。结果：本部分研究发现,ALDH2-/-小鼠基础状态心肌组织内p-AMPK及PPARa蛋白水平表达明显减少,TAC术后改变不明显,提示ALDH2敲除能够独立抑制能量代谢上游关键分子；ALDH2-/-小鼠基础状态mCPT-I RNA表达下降,且在压力超负荷刺激后进一步下降；PDH RNA水平在四组小鼠心肌中表达无明显差异。细胞水平结果与心肌组织结果相似,但PPARa在牵张后有下降趋势。结论：本部分研究通过分子信号水平的观察,证实ALDH2-/-可促进压力超负荷可引起能量代谢模式重构是通过对p-AMPK,PPARa及其下游的mCPT-I通路调控引起的,该通路主要抑制脂肪酸利用,反馈性的引发葡萄糖利用升高,从而促进心肌能量模式重构。