单克隆抗体一直以来都被作为研究T淋巴细胞表面分子的重要工具。国外研制的鸡CD分子的单克隆抗体为研究免疫细胞的生理功能及细胞表面标志的生物学作用等创造了有利条件,他们可以利用这些单克隆抗体对淋巴细胞进行分选,以研究免疫应答类型;或用于消耗动物体内相应的CD分子,以研究CD分子在体内的作用;也可用于研究CD分子的结构、功能等。本实验旨在研制特异性的抗鸡CD8α的单克隆抗体,特别是适用于间接免疫荧光试验、细胞分析与分选等流式细胞术的单克隆抗体。研究中首先利用淋巴细胞分离液制备白莱航鸡脾脏和胸腺的淋巴细胞,接着用制备的淋巴细胞免疫3只6周龄的雌性BALB/c小鼠。在经过两次免疫后,眼静脉窦采血,分离血清,应用间接免疫荧光试验测定血清效价。达到1:1280后,进行加强免疫。3天后,无菌条件下取BALB/c小鼠的脾脏细胞与培养到对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0在PEG4000的作用下进行融合。5天后添加新鲜的HAT培养基,10天后更换HT培养基。待融合细胞上清变黄后即可进行阳性克隆的筛选。采用间接免疫荧光染色结合FACS分析筛选阳性克隆。应用本室构建的稳定表达鸡CD8α的细胞系Flp-in-293-CD8α-FLAG与杂交瘤上清进行间接免疫荧光染色,通过流式细胞术检测荧光率筛选出阳性杂交瘤克隆。同时设立商品化的纯化的鼠抗鸡CD8α抗体的阳性对照。再经过2次有限稀释法亚克隆,筛选到了一株稳定分泌抗鸡CD8α的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6E5。将杂交瘤细胞6E5腹腔注射预先用石蜡处理的BALB/c小鼠,制备6E5腹水。间接免疫荧光FACS试验测定腹水效价,达到1:1204000。应用抗原介导的ELISA方法,测得6E5的亚类为IgG1。应用CD3/CD8双色免疫荧光结合FACS分析进一步鉴定单克隆抗体。取白莱航鸡的脾脏淋巴细胞,第一步通过间接染色的方法标记6E5抗鼠FITC,第二步通过直接染色的方法标记CD3-PE。同时设立商品化的纯化的鼠抗鸡CD8α抗体为一抗的阳性对照。结果显示,6E5是一株分泌抗鸡CD8α的单克隆抗体的杂交瘤细胞。将6E5与商品化的鼠抗鸡CD8α抗体(CLONE:CT8)进行抗原表位的比较。取白莱航鸡的淋巴细胞,加入不同含量的6E5杂交瘤细胞制备的腹水,接着加入相应含量的CD8-PE(CLONE:CT8)。如果6E5与商品化的鼠抗鸡CD8α抗体(CLONE:CT8)是识别相同的表位,那么随着6E5腹水量的升高,荧光率应该降低。但是实验的结果表明,荧光率不随着6E5浓度的升高而降低,说明两者不是针对同一抗原表位。应用单克隆抗体6E5测定与白莱航品系鸡不同组织中淋巴细胞的反应性。取白莱航鸡的胸腺、脾脏、法氏囊淋巴细胞,与6E5腹水分别反应。结果表明,6E5可以识别胸腺、脾脏淋巴细胞里表达CD8 T淋巴细胞。但是不与法氏囊淋巴细胞反应,这主要是因为法氏囊淋巴细胞是B淋巴细胞。应用单克隆抗体6E5测定与不同品种(系)的家禽的淋巴细胞的反应性。选取隐性白羽鸡、石岐杂鸡、狼山鸡、安卡鸡、龙溪麻鸡、康贝尔鸭、鸦鸭、扬州鹅八种家禽,分别采集外周血,制备外周血淋巴细胞,测定6E5与不同品系的家禽的淋巴细胞的反应性。结果显示,6E5可以特异的识别鸡的外周血淋巴细胞中表达CD8的T淋巴细胞,不能识别康贝尔鸭、鸦鸭、扬州鹅外周血淋巴细胞。在鸡的免疫试验中,进一步应用单克隆抗体6E5测定了不同免疫组的鸡的免疫水平。利用本室构建的猪霍乱沙门菌C500△asd(pYA3334)菌株、猪霍乱沙门菌C500△asd(pYA3334-F)菌株免疫20日龄海兰白鸡,同时设立不免疫的阴性对照。在第一次免疫后14天、第二次免疫后7天、第二次免疫后14天,分别取不同免疫组的海兰白鸡,制备脾脏淋巴细胞,利用间接方法标记6E5抗鼠PE。再标记CD4-FITC,流式细胞仪检测CD4与CD8百分含量。同时设立商品化鼠抗鸡CD8α抗体的阳性对照。通过CD4与CD8的百分含量的比值判断不同免疫组的白莱航鸡的免疫水平。6E5测得的结果与商品化的鼠抗鸡CD8α抗体得到的结果相同。说明6E5是一株可以应用于流式细胞术检测的单克隆抗体。