全世界每年有超过1100万患者遭受不同程度的烧伤,其中96%的患者诉烧伤急性期伴随剧烈的疼痛,52%的患者诉在皮损愈合后疼痛持续存在,其中66%认为疼痛影响身体康复,55%认为疼痛严重影响日常生活;其中60%以上的患者对疼痛的管理靠“转移注意力”、“家庭治疗”等方式;目前对烧伤后的慢性疼痛缺少特效的治疗药物,主要镇痛药物为阿片类药物,镇痛效果并不理想,而且还有一些患者存在药物滥用问题。烧伤后的慢性疼痛不仅出现在皮损区域,而且在未受热损伤的皮肤部位也表现出触诱发痛和感觉异常,目前认为热损伤后的慢性疼痛是一种神经病理性疼痛,其形成过程有中枢敏化的成分,临床上这种现象一般发生在皮损面积较大的Ⅱ°和Ⅲ°烧伤的患者,浅表的Ⅰ°烧伤患者一般不产生慢性疼痛。调查研究发现,热损伤后的慢性疼痛主要表现为触觉痛阈降低,其温度觉痛阈受影响较小。热损伤后神经病理性疼痛的产生主要由于皮肤的神经组织不良愈合、形成错构,导致中枢敏化,产生神经病理性疼痛。染色体是由DNA和组蛋白(Histone)通过离子键相结合并不断螺旋形成的,组蛋白可以影响基因转录活性,组蛋白乙酰化修饰是基因转录调控的重要机制:组蛋白乙酰化酶(Histone Acetylases,HAT)通过催化组蛋白乙酰化,激活基因转录;而组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)通过组蛋白去乙酰化,抑制基因转录。沉默调节蛋白(Sirtuin)属于第Ⅲ类HDAC,人类基因组中存在7类Sirtuin(SIRT1-7),SIRT1存在于细胞核中,作用于细胞核中的组蛋白,调节基因表达。近年来的研究表明,SIRT1、HDAC和组蛋白乙酰化状态的失衡与神经病理性疼痛相关,但是其具体的作用存在争议。早期的观点认为,在神经病理性疼痛的大鼠模型中,脊髓水平SIRT1表达水平减低,其去乙酰化活性降低,而鞘内给予HDAC激动剂白藜芦醇(Resveratrol,RSV)可以产生镇痛作用。近年来的一些研究则指出,HDAC抑制剂丁酸钠、曲骨抑菌素A(Trichostatin A,TsA)、丙戊酸(Valproic Acid,VPA)等,可以通过提高乙酰化组蛋白水平,促进基因转录(例如亲代谢型谷氨酸受体 2(metabotropic glutamate receptor 2)、δ_阿片受体等),进而起到镇痛作用。关于这一争议,目前的解释有很多:一是HDAC抑制剂的镇痛作用一般为增加受体表达,因此可以作为阿片类药物的辅助用药;二是目前共发现有4类HDAC,SIRT1属于第3类,RSV仅作用于SIRT1而不影响其他几类HDAC,而VPA、TsA则是第1类、第2类HDAC抑制剂。Bai等人的研究认为热损伤局部和损伤部位远处的SIRT1升高,具有抑制凋亡、修复组织的作用,而热损伤后脊髓SIRT1的变化以及热损伤后慢性疼痛与脊髓SIRT1之间的关系目前尚未见报道。RSV是存在于天然植物中的多酚类物质,RSV对突出髓核导致的疼痛、神经病理性疼痛以及炎性痛方面都显示出了一定的镇痛作用。在神经病理性疼痛的镇痛方面,Yin等人的研究证明,在慢性压迫性损伤(Chronic Constriction Injury,CCI)之后即刻鞘内注射RSV可以推迟神经病理性疼痛的形成,在CCI后4-7天鞘内注射RSV可以抑制神经病理性疼痛的程度。Shao等人的研究中,CCI之前1小时,鞘内注射RSV可以延迟神经病理性疼痛的发展,表明RSV对于神经病理性疼痛的形成是有一定的预防作用的,而且以上研究认为RSV的镇痛作用是与SIRT1相关的。Sharma等人认为RSV对糖尿病周围神经病变的大鼠具有治疗作用,但机制是通过SIRT1之外的其他途径实现的。RSV对热损伤疼痛(Burn Injury Pain,BIP)大鼠有无治疗作用以及作用机制目前尚未见报道。基于以上背景,我们进行了本次研究,目的在于探讨鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用以及可能的作用机制,内容共分两个部分,每个部分包含两个实验。第一部分鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用以及对脊髓SIRT1/Ac_H3的影响目的:建立BIP大鼠模型,验证鞘内注射RSV对BIP大鼠的镇痛作用,并检测大鼠脊髓SIRT1/Ac_H3的变化。方法:(1)实验一:大鼠随机分为3组:naive组、sham组、BIP组;BIP组采用85.0±0.5℃,保持10g的压力,精确控制持续加热15秒的方法进行BIP大鼠的动物模型制作;以Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、5、7、9、11、14和21d的机械缩足反射阈值(PMWT);以Western Blot检测各组大鼠在热损伤后第3、7、14、21d的脊髓SIRT1/Ac_H3的表达。(2)实验二:将大鼠随机分为7组:sham组、sham+DMSO组、sham+400μgRSV 组、BIP 组、BIP+DMSO 组、BIP+200μgRSV 组和 BIP+400 μgRSV 组;BIP造模方法参照实验一;热损伤后第7-9d,连续3d鞘内给药(sham+DMSO组和BIP+DMSO组鞘内给予对照剂DMSO、BIP+200 μ gRSV组鞘内给予200 μ gRSV、sham+400 μ gRSV 组和 BIP+400 μ gRSV 组鞘内给予 400 μ gRSV),以 Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、7、9、14和21d的PMWT;以 Western Blot 检测其中 5 个组(sham 组、sham+DMSO 组、BIP 组、BIP+DMSO组和BIP+400 μ gRSV组)大鼠在热损伤后第9d的脊髓SIRT1/Ac_H3的表达。结果:(1)实验一:热损伤后第1d,BIP组大鼠患侧肢体PMWT降低(持续至热损伤后21d),与naive组相比有统计学差异(P<0.05);热损伤后第7d,BIP组大鼠健侧肢体PMWT降低(持续至热损伤后21d),与naive组相比有统计学差异(P<0.05);热损伤后第7、14、21d,BIP组大鼠脊髓SIRT1/Ac_H3表达增加,与naive组相比有统计学差异(P<0.05)。(2)实验二:热损伤后第7-9d,鞘内给药后,BIP+200 μgRSV组和BIP+400μgRSV组与BIP组相比,大鼠PMWT升高,差异有统计学意义(P<0.05);BIP+DMSO组与BIP组相比,大鼠PMWT无统计学差异(P>0.05);BIP+200 μgRSV组和BIP+400 μgRSV组两组之间大鼠PMWT无统计学差异(P>0.05)。热损伤后第14、21d,BIP+200 μ gRSV组和BIP+400 μ gRSV组两组大鼠PMWT降低,与BIP组相比无统计学差异(P>0.05)。热损伤后第9d,BIP+400μgRSV组脊髓SIRT1表达增加,Ac_H3降低,与BIP组相比有统计学差异(P<0.05);BIP+DMSO组与BIP组相比,在脊髓SIRT1/Ac_H3表达方面,无统计学差异(P>0.05)。结论:RSV对BIP大鼠具有镇痛作用,其作用机制可能是通过激活脊髓SIRT1实现的,因此RSV有可能成为治疗BIP的药物之一。第二部分鞘内应用SIRT1抑制剂对大鼠PMWT的影响以及对RSV镇痛作用的影响目的:测定SIRT1的高选择性抑制剂EX527是否影响大鼠PMWT,以及是否影响RSV对BIP大鼠的镇痛作用。方法:(1)实验一:将大鼠随机为分6组,naive组、DMSO组、EX527 6.4μg 组、EX527 8μg组、EX527 10μg 组和 EX527 12.5 μg 组;后 4 组大鼠鞘内分别注射不同剂量的EX527,以Von Frey法测量各组大鼠置管前、给药前、以及给药后第 30、60、90、120、150、180min 的 PMWT。(2)实验二:将大鼠随机分为5组,sham+DMSO+DMSO组、BIP+DMSO+DMSO组、BIP+EX527+DMSO 组、BIP+DMSO+RSV 组、BIP+EX527+RSV 组;BIP 造模方法见第一部分;热损伤后第7d,BIP+EX527+DMSO组和BIP+EX527+RSV组鞘内给予EX527 8μg预处理,1h后BIP+EX527+RSV组鞘内给予RSV 400μg,连续给药3d,以Von Frey法测量各组大鼠在热损伤前以及热损伤后第1、3、7、9、14 和 21d 的 PMWT。结果:(1)EX527 10 μ g 组和 EX527 12.5 u g 组,在给药后第 30、60、90min时大鼠PMWT降低,与naive组相比有统计学意义(P<0.05);至给药后第120、150、180min,大鼠PMWT与naive组相比则无统计学意义(P>0.05),EX5276.4 μ g组和EX527 8 μ g组大鼠PMWT与naive组相比,各时点均无统计学意义(P>0.05)。(2)热损伤后第7d和第9d,BIP+DMSO +RSV组和BIP+EX527+RSV组大鼠PMWT均有升高,与BIP+DMSO+DMSO组相比有统计学差异(P<0.05);BIP+EX527+RSV组和BIP+DMSO +RSV组相比,大鼠PMWT降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SIRT1高选择性抑制剂EX527预处理可以降低RSV对BIP大鼠的镇痛作用,RSV对BIP大鼠的镇痛作用至少部分是通过激活SIRT1实现的。