产志贺氏毒素大肠杆菌(STEC)是一类肠道病原体的总称,可以在全球范围内引起局部地区零散的感染和广泛的地区疾病爆发。STEC O157作为一种产志贺氏毒素大肠杆菌,可以在人体宿主内引起胃肠道疾病,如出血性结肠炎(血性腹泻)和溶血性尿毒综合征(HUS),其发病率和死亡率都很高。STEC O157通过粪口途径传播,一旦进入人体会在大肠中增殖,产生毒素并发挥毒力效应而致病。常规检测方法有分离培养、生化鉴定及血清型鉴定等,检测过程复杂且耗费时间,故近年来针对STEC O157的荧光定量PCR检测方法陆续发展起来,然而这些方法大多是对其单个基因来进行检测,如果所选择的毒力靶基因缺失则会导致出现假阴性结果。值得注意的是,一些毒力基因并非STEC O157特有,也存在于最常见的6种非O157型STEC(026,045,0103,0111,0121,0145)当中,故被检测为阳性的样品需要进一步试验以确认血清型,无法达到快速检测的目的。因此,需要建立一种快速、准确的多重荧光定量PCR检测方法。STEC O157最常见的毒力相关基因包括hlyA、eaeA、stx2、rfbE和fliCH7,本研究选择其rfbE、stx2、eae为靶基因,建立三重荧光定量PCR检测方法,同时对该方法展开特异性、灵敏性及重复性实验分析,综合评估该方法对STEC O157的检测效力,并应用于江苏某地区牛场的牛粪样品中STEC O157病原的检测,建立STEC O157的临床检测手段。1 STEC O157三重荧光定量PCR检测方法的建立本研究选择STEC O157的高特异性O抗原基因rfbE,与大多数O157菌株都具有的stx2、eae两个毒力基因进行组合,建立三重荧光定量PCR检测方法。首先开展了特异性实验,结果显示只有存在以上三个基因的大肠杆菌O157:H7产生三条扩增曲线,大肠杆菌026、K88ac、BL21、DH5α、鼠伤寒沙门氏菌W32、肠炎沙门氏菌C50336菌株以及阴性对照和空白对照组均无法产生三条扩增曲线,说明该方法特异性强。其次通过灵敏性实验,分析了rfbE、stx2、eae三个基因各自的检测灵敏度,结果表明菌液浓度为101CFU/mL时三个基因均产生扩增曲线,该方法的最低检出限为101CFU/mL,灵敏度较高。最后开展了重复性实验,结果表明在同一菌液浓度下,三组平行组间rfbE、stx2、eae三个基因各自的Ct值相差不超过1,说明反应中各基因的Ct值较为稳定,该方法重复性好。总之,基于以上实验分析,本研究成功建立了用于快速检测STEC O157的三重荧光定量PCR方法,为后续对江苏某地区部分牛场粪便样品进行临床检测奠定了基础。2对江苏某地区部分牛场粪便样品的临床检测本次对牛粪便中STEC O157病原的临床检测针对江苏扬州地区两个不同的牛场来进行,以便了解不同牛群的带菌情况和该地区整体的STEC O157流行分布情况。扬大农牧牛场和江都荷龙牛场各250份牛粪样品的检测结果表明:扬大农牧牛场中STEC O157的阳性检出率为2.4%,而江都荷龙牛场中STEC O157的阳性检出率为0%。总之,扬州地区的STEC O157分布是不均衡的。此外,在对总共500份牛粪样品的检测结果的分析中也发现,尽管所有样品中STEC O157的阳性检出率仅为1.2%,但仍然有许多样品在三重荧光定量PCR检测过程中出现了s x2和eae两个基因的扩增曲线,这说明样品中可能存在其他类型的大肠杆菌或是非O157型STEC。综上所述,本实验建立的三重荧光定量PCR在针对STEC O157进行检测的同时,也可以分析其他类型的大肠杆菌以及非O157型STEC的流行分布情况。本研究将经三重荧光定量PCR检测出的6份阳性样品进行传统PCR检测,发现两种方法的检测效力存在显著差异。传统PCR仅检测出1份阳性结果,这表明三重荧光定量PCR的阳性检出率更高,为牛粪中STEC O157病原的有效检测手段。